牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达

冷欢，张幸，刘家书，赵勇，李谞，江正兵，宋慧婷

（1.湖北省工业生物技术重点实验室（湖北大学），湖北武汉430062；2.湖北大学资源环境学院，湖北武汉430062）

0 引言

凝乳酶是从未断奶的小牛第四胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶，它可以切断牛乳κ－酪蛋白的Phe－Met肽键，导致牛乳凝结［1］.在小牛皱胃中，凝乳酶通常合成为一个含有381个氨基酸的前体聚肽—凝乳酶原前体，凝乳酶原前体在分泌过程中去掉16个信号肽形成含有365个氨基酸的凝乳酶原［2］.凝乳酶原无活性，它在酸性pH下通过多步的自动催化过程，去掉N末端42个氨基酸形成有活性的含有323个氨基酸的蛋白－凝乳酶［3］.目前，凝乳酶年均需求量为2.5×107L，约占全世界酶制剂总量的15%，居第二位［4］.传统的凝乳酶来源于小牛皱胃.但是随着世界奶酪产业的不断壮大，单纯靠宰杀大量的小牛获取凝乳酶显然与现代工业的发展不相符，植物凝乳酶虽然来源广泛，但是其蛋白水解力强，并且受时间、地点等的限制难以发展.微生物凝乳酶从1965年起开始取代小牛皱胃酶生产干酪以来，成功地弥补了小牛凝乳酶短缺的问题，并在奶酪制造业与酪素产业中得到了广泛的应用.目前利用微生物凝乳酶生产的干酪已占世界干酪总产量的1／3［5］.目前，在我国利用毕赤酵母表达牛凝乳酶的报道较少，在毕赤酵母宿主菌中分泌表达的凝乳酶的结构以及酶学性质在相应的报道中研究的并不全面，并且微生物中表达得到凝乳酶代替屠杀小牛来提取小牛凝乳酶更具有现实意义.因此，凝乳酶基因在毕赤酵母中表达这一研究值得我们进一步考究.

1 实验部分

1.1 材料 菌种和质粒：Escherichia.coli XL10－Gold，毕赤酵母GS115由本实验保存.

1.2 试剂与培养基 限制性内切酶：SfiⅠ、MunⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ，T4DNA连接酶，EX TaqDNA聚合酶，DNA markers购自TaKaRa公司.

实验所用培养基主要有：LB、YPD、MD、BMGY、BMMY培养基的组成和配制参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册.

1.3 实验仪器 TaKaRa梯度PCR仪购自TaKaRa公司；冰冻离心机购自Sigma公司低温冰箱合肥美菱股份有限公司；电热恒温培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司；UV－2550分光光度计上海棱光技术有限公司.

1.4 实验方法

1.4.1 载体pPIC9K－prochy构建 GenBank中找到凝乳酶的基因编号为：NM＿180994.1.由上海捷瑞生物工程有限公司基因合成，合成基因克隆于质粒pUC19.将pUC19－prochy用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，得到prochy基因片段.用质粒pPIC9k分别EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，分别回收载体和目的基因的双酶切产物，用T4DNA连接酶在16度下连接，构建表达载体pPIC9K－prochy.将连接产物转化大肠杆菌XL10－Gold，用LB琼脂平板（Amp 25mg／mL）筛选，抽提质粒DNA.SalⅠ和EcoRⅠ双酶切验证.

1.4.2 构建表达载体pPIC9K－prochyQ（去掉凝乳酶基因中的信号肽序列） 根据对酵母表达载体pPIC9K的限制性酶切位点分析，并参考本实验室已克隆的凝乳酶基因序列（GenBank Accession No.NM＿180994.1），在基因上下游设计特异引物，序列见表1，引物由上海英骏生物工程有限公司完成.这对引物主要用于去掉凝乳酶原前端信号肽序列，凝乳酶原的氨基酸序列中前16个氨基酸为信号肽.Prochymosin－EcoR1－F这段引物从49位碱基开始.将得到的PCR产物胶回收后用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，即得到prochy－Q（去掉凝乳酶原基因前端的48个信号肽的碱基序列）［6］.用质粒pPIC9K分别EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切.将分别回收载体和目的基因的双酶切产物用T4DNA连接酶在16度下连接，构建表达载体pPIC9K－prochyQ.将连接产物转化到大肠杆菌感受态中，用LB琼脂平板（Amp25mg／mL）筛选，抽提质粒DNA.SalⅠ和EcoRⅠ双酶切验证.

表1 本实验中使用的引物

1.4.3 电转化毕赤酵母GS115 使用SalⅠ酶切重组质粒pPIC9K－prochy以及pPIC9K－prochyQ使其线性化.通过电脉冲法将线性化的质粒转化到毕赤酵母GS115中，MD平板筛选转化子［7］.

1.4.4 阳性克隆的功能鉴定 将筛选得到的阳性克隆分别接种于含50mL BMGY液体培养基的500mL的三角瓶中，于28℃摇床上培养待OD值达到2～6时，再分别将其接种于含50mL BMMY液体培养基的1 000mL的三角瓶中.每24h加一次甲醇使其终体积参数为0.5%，培养4d后，收集培养液上清.采用Arima K的方法对上清进行凝乳活力（milk clotting activity，MCA）的测定［8］.

用0.01mol／L的CaCl2溶液配制10%脱脂乳，此溶液配制后在室温下放置40min后使用，取5mL10%脱脂乳于35℃保温10min，加入适量稀释的酶液，震荡均匀并开始计时，观察管壁上开始出现凝乳颗粒为终点，记录凝乳时间（t／min），在上述条件下，40min凝结1mL10%脱脂乳的酶量定义为一个Soxhlet单位（SU）.

1.4.5 重组凝乳酶的酶学特性的研究 收集BMMY培养基上清，将其保存在4℃冰箱，随后我们对重组凝乳酶进行一系列的酶学特性的分析.如凝乳酶反应的最适pH，凝乳酶的pH值稳定性，凝乳酶的热稳定性，反应的最适温度［9］.

1.4.5.1 凝乳酶反应的最适pH值 用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH将脱脂奶粉的pH值调到5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在37℃下测定重组凝乳酶的活性.将最高活力定义为100%，分别计算不同pH值条件下凝乳酶的相对酶活力.

1.4.5.2 凝乳酶的pH值稳定性 用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH将酶液的pH值调到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在4℃下放置l h后，再用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH将酶液的pH值调到6.0，在37℃下测定重组凝乳酶的残余酶活，将最高活力定义为100%，分别计算不同pH值条件下凝乳酶的相对酶活力.

1.4.5.3 凝乳酶的热稳定性 将酶液分装于试管中，分别在40、50、55℃水浴中温育，每隔10min取样，迅速冷却，在37℃下测定残余重组凝乳酶的活性.将未处理酶液的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下凝乳酶的相对酶活力.

1.4.5.4 重组凝乳酶的最适反应温度 将酶反应体系在20、25、30、35、40、45、50℃等温度下检测重组凝乳酶的活性，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下凝乳酶的相对酶活力.

2 结果部分

2.1 载体pPIC9K－prochy和载体pPIC9K－prochyQ构建图谱与酶切鉴定 根据以上的构建方法，得到重组载体质粒pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ.其构建图谱和酶切鉴定如图1～3所示.pPIC9K、pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ经过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切后理论上会分别得到大小为1 900bp，3 100bp，3 100bp小片段，这与我们实际得到的（如图3所示）片段相符.

图1 载体pPIC9K－prochy构建过程

图2 载体pPIC9K－prochyQ构建过程

图3 pPIC9k和pPIC9k－prochy pPIC9k－prochyQ的酶切检测结果M为λ－EcoT14Ⅰdigest DNA marker；9K、Y、Q分别对应为pPIC9K、pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ质粒经过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切后的电泳图.

2.2 阳性克隆的功能鉴定 通过构建成功的表达载体pPIC9K－prochy，pPIC9K－prochyQ线性化后使用电脉冲法将线性化的质粒转化到毕赤酵母GS115中，MD平板筛选转化子.我们使用摇瓶诱导的方法共筛选了120株重组菌，得到3株菌株表达的凝乳酶有明显的凝乳活性，分别命名为GS115／pPIC9K－chy1（表达载体为pPIC9K－prochy，保留凝乳酶基因中的信号肽），GS115／pPIC9K－chy20（表达载体为pPIC9K－prochy，保留凝乳酶基因中的信号肽），GS115／pPIC9K－chy8Q（表达载体为pPIC9K－prochyQ，去掉凝乳酶基因中的信号肽）.如图4，将这3株菌株摇瓶诱导得到的上清粗酶液进行功能鉴定，从左至右分别是GS115／pPIC9K－chy1，GS115／pPIC9K－chy20，GS115／pPIC9K－chy8Q，GS115／pPIC9K（对照）.

2.3 重组凝乳酶的活力曲线 将筛选得到的3株酵母重组菌株分别接种于诱导培养基BMMY中，每24 h加一次甲醇至终浓度为0.5%并取1mL培养液测其凝乳酶的活力以绘出凝乳酶的活力曲线.重组凝乳酶（来自于GS115／pPIC9K－chy1菌株）的活力曲线如图5，144h时有较大幅度的增长，在168h时有最大酶活，另外两种菌株表达的凝乳酶的酶活也在144h后有较大幅度的增长.

2.4 重组凝乳酶的最适反应pH值 将筛选得到的3株酵母重组菌株分别接种于诱导培养基BMMY中，每24h加一次甲醇至终浓度为0.5%并取1mL培养液测其凝乳酶的活力以绘出凝乳酶的相对酶活.重组凝乳酶（来自于GS115／pPIC9K－chy1菌株）的相对酶活曲线如图6.图中可以看到重组凝乳酶在pH值为6.0时酶活最高.

图4 阳性克隆的功能鉴定

图5 重组凝乳酶的酶活特性

图6 重组凝乳酶的最适反应pH

2.5 重组凝乳酶的pH稳定性 将酶在不同pH梯度下处理1h后，结果如图7所示.随着pH值的增加，重组凝乳酶的活性随着增加，当pH为4～7时，凝乳酶有较好的稳定性.在pH为7.0时，重组凝乳酶有最大酶活，当pH大于7.0时，随着酶的变性导致酶活力迅速下降.在pH等于9.0时，凝乳酶几乎没有活性，推测是由于酶发生不可逆变性导致，可认为酶活为0.

2.6 凝乳酶的热稳定性 如图8所示，重组凝乳酶在50℃以下可以保持相对稳定的活性，当温度超过55℃时，凝乳酶的活性迅速下降.

图7 重组凝乳酶的pH稳定性

图8 凝乳酶的热稳定性

2.7 重组凝乳酶的最适反应温度 如图9所示，当温度低于30℃时，由于温度太低，凝乳反应几乎不能发生，随着温度的升高，凝乳酶的活性逐渐增加，达到45℃时有最大反应活性，随着温度继续升高，酶的活性迅速下降.

图9 温度对重组凝乳酶活性的影响

3 结论

本实验筛选到了3株重组菌株——GS115／pPIC9K－chy1、GS115／pPIC9K－chy20、GS115／pPIC9K－chy8Q.通过Arima K酶活测试方法，确定了这3种菌株表达的凝乳酶都具 有一定的凝乳特性，其中GS115／pPIC9K－chy1的活性最高为1.905SU／mL，GS115／pPIC9K－chy20其次，GS115／pPIC9K－chy8Q表达得到的凝乳酶的酶活相对最小.前两株重组菌为没有去掉凝乳酶基因中的信号肽，GS115／pPIC9K－chy8Q为去掉了凝乳酶基因中的信号肽.据此我们有两种推测，一是凝乳酶本身含有的前导肽可能对凝乳活性产生有利影响；二是由于GS115－pPIC9K－chy1和GS115－pPIC9K－chy20这两种菌株中所含的目的基因的拷贝数多于GS115－pPIC9K－chy8Q，推测二可以通过Southern－blot来检测这3种菌株中所含的目的基因的拷贝数，从而证实其正确与否.

重组凝乳酶的最适反应温度为45℃，在50℃以下可以保持相对稳定的活力，当温度高于55℃时酶的活力迅速下降，重组凝乳酶的最适pH值为6.0.当酶液的pH为4～7时，凝乳酶有较好的稳定性，在pH为7.0时，重组凝乳酶最稳定，当pH大于7.0时，随着酶的变性导致酶活力迅速下降.通过重组凝乳酶的活力曲线得出，144h后凝乳酶的酶活有明显的提高.通过酶学特性的研究，证明了重组凝乳酶与商品凝乳酶的酶学特性相近，至于将其应用到工业化食品奶酪的加工［10］生产还需要我们进一步研究.

［1］李璐，张旭，李杰.农杆菌介导凝乳酶基因转化黑曲霉载体的构建［J］.生物技术，2011，21（4）：8－12.

［2］Cardoza R E，Gutierrez S，Ortega N，et al.Expression of a synthetic copy of the bovine chymosin gene in Aspergillus Awamori from constitutive and pH－regulated promoters and secretion using two different pre－pro sequences［J］.Biotechnol Bioeng，2003，83（3）：249－259.

［3］Moller K K，Rattray F P，Sorensen J C，et al.Comparison of the hydrolysis of bovineκ－casine by camel and bovine chymosin：a kinetic and specificity study［J］.Journal of Agriculture Food Chemistry，2012，60（21）：54－60.

［4］徐波，张莉，王景会，等.干酪加工专用凝乳酶及其基因工程酶的研究［J］.中国乳品工业，2009，37（4）：46－50.

［5］刘佟，崔艳华，张兰威，等.凝乳酶的研究进展［J］.中国乳品工业，2011，39（8）：40－43.

［6］张健，张莉，李玉秋，等.重组毕赤酵母产凝乳酶发酵条件研究［J］.中国酿造，2011，10（235）：55－58.

［7］Valleio J A，Ageitos J M，Poza M，et al.Short communication：A comparative analysis of recombinant chymosin［J］.Journal of dairy science，2012，95（2）：609－613.

［8］Arima K，Shinjiro I，Gakuzo T.Milk－clotting enzymes from microorganism（PartⅠ）：screening test and identification of potent fungus［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1967，31（5）：540－545.

［9］Maria C V，Alicia G C，Villar J，et al.Molecular cloning and expression in yeast of Caprine Prochymosin［J］.Journal of Biotechnology，2004，114：69－79.

［10］Marx H，Mecklenbr Uker A，Gasser B，et al.Directed gene copy number amplification in pachia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus［J］.FEMS Yeast Reseach，2009，9（8）：1260－1270.