米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶酶学特性研究

朱建宁，张卫兵，张忠明，杨敏，文鹏程，宋雪梅，张丹妮

（1.甘肃省食品药品监督管理局，甘肃兰州730000；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶酶学特性研究

朱建宁1，张卫兵2*，张忠明2，杨敏2，文鹏程2，宋雪梅2，张丹妮2

（1.甘肃省食品药品监督管理局，甘肃兰州730000；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

以米黑毛霉凝乳酶为研究对象，研究反应温度、pH值、脱脂乳浓度、金属离子对凝乳酶活力的影响。结果表明，米黑毛霉凝乳酶最适反应温度为75℃，在35℃～45℃稳定性较好；米黑毛霉凝乳酶的最适pH值为6.0，在pH值为7.0～10.0时较为稳定；脱脂乳浓度为20.0%时，相对凝乳酶活力达到最大值；Mn2+、Mg2+、Na+对凝乳酶的凝乳活力有促进作用，K+、Sn2+、Cu2+对凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。

凝乳酶；米黑毛霉；酶学特性

凝乳酶是一种最早在未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成为干酪生产中形成质构和特殊风味的关键性酶，被广泛应用于奶酪制作。动物凝乳酶最早被用于干酪生产，应用也最为广泛，其产值占总量的70%。据统计，全世界每年要宰杀5 000万头小牛，以获得凝乳酶，造成全球性小牛短缺，由于原料缺乏，凝乳酶价格昂贵。植物凝乳酶虽然来源广泛，但其蛋白水解力强，并且受时间、地点等限制难以发展[1]。微生物由于生长周期短，产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低、提取方便、经济效益高，可以节约动、植物资源，所以微生物凝乳酶成为凝乳酶研究的热点[2]。

国产凝乳酶的种质资源主要包括毛霉类、根霉类和曲霉类[3]。不同来源微生物凝乳酶的酶学特性差异很大。高维东等[4]对微小毛霉凝乳酶的酶学性质进行研究，结果表明酶的最适温度为60℃，最适pH值为5.5，在65℃保温5min活力损失95%；钙离子是酶的激活剂，其含量与酶活力正相关，而钾离子则对酶有抑制作用，氯化钠对酶活力的影响不大。潘道东等[5]研究表明，根霉凝乳酶最适pH为5.7，在pH值为5.0～7.5时酶活力保持稳定；最适反应温度45℃，60℃保持20min，则完全失活。

本试验以米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶为对象，研究反应温度、pH值、脱脂乳浓度、金属离子对凝乳酶活力的影响，以期为凝乳酶的研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料米黑毛霉菌株：菌株为米黑毛霉UV-LiCl-6，由本实验室选育并保藏。脱脂乳粉：黑龙江完达山乳业股份有限公司。麸皮，马铃薯。所用试剂均为市售国产分析纯或化学纯。

活化培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH值自然。基础发酵培养基：将麸皮与水按1∶0.8（w/v）的比例混合，搅拌均匀，在121℃、0.15 MPa下灭菌20min。发酵培养基：将麸皮与营养液按1∶0.8（w/v）的比例混合，搅拌均匀，在121℃、0.15MPa下灭菌20min。

营养液：葡萄糖2.5 g，乳清粉2.0 g，硝酸铵1.0 g，以蒸馏水溶解后，盐酸调pH值至6.0，定容到100m l。

1.1.2 实验设备HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；AL204电子天平，梅特勒—托利多仪器上海有限公司；GZX-GF101-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；NRY-200恒温摇床，上海南荣实验室设备有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；SW-CJ-ZFD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化将米黑毛霉菌株UV-LiCl-6接种于斜面培养基进行活化，32℃培养4～5 d，待长满黑色孢子后备用。

1.2.2 孢子悬浮液的制备向生长良好的试管斜面种子中加入10m l无菌生理盐水，刮下孢子，移入装有玻璃珠和无菌生理盐水的三角瓶中振荡，在摇床上振荡打散，再用带脱脂棉的漏斗进行过滤，调整孢子数为106个/m l。

1.2.3 粗酶液的制备将1 m l米黑毛霉种子液接入发酵培养基，32℃恒温培养72 h。培养完成后，加入100 m l蒸馏水，20℃、180 r/min振荡浸提1 h，浸提液用4层纱布过滤，滤液以10 000 r/min离心20min，上清液即为粗酶液。

1.2.4 酶活力的测定凝乳酶活力测定采用Arima等[6]的方法，用0.01 mol/L氯化钙液配制10%脱脂奶粉液，配制后在室温放置40min以上使用，当天使用，不宜冰箱放置。取5 m l 10%脱脂奶粉液在35℃保温10 min，加0.5 m l适当稀释的酶液（35℃保温），立即摇匀，开始计时（凝乳时间控制在40～90 s），并把试管倾斜45°以上。沿试管周旋转，以试管壁出现小颗粒为终点，记录凝乳时间。在上述条件下，将40min凝1 m l 10%脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位（SU）。

公式中，D为酶液稀释倍数，t为反应时间。

1.2.5 反应温度对凝乳酶活力的影响将作用底物脱脂乳溶液分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃下保温5min，把适当稀释的凝乳酶在35℃下保温5min待用，分别在相应温度下加入0.5m l酶液测定凝乳酶活力，获得最高凝乳酶活力为100%（对照），计算相对凝乳酶活力[7]。

1.2.6 凝乳酶的热稳定性将酶液分别在35℃、45℃、55℃、65℃、70℃下保温0、10、20、30、40、50、60min后，测定残余凝乳酶活力，以未保温酶液的凝乳酶活力为100%（对照），计算相对凝乳酶活力。

1.2.7 pH值对凝乳酶活力的影响用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH将脱脂乳和酶液pH值调至5.5、6.0、6.5、7.0，测定不同反应体系下的凝乳酶活力，以获得的最高凝乳酶活力为100%（对照）。

1.2.8 凝乳酶的pH稳定性分别用0.1 mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液（pH值2.5～4.0）、柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH值4.5～ 5.5）、磷酸钠缓冲液（pH值6.0～8.5）、碳酸盐缓冲液（pH值9.0～11.0）将酶液的pH值分别调节到3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，在室温下放置24 h，再将pH值调到5.5，测定残余的凝乳酶活力，以获得最高凝乳酶活力为100%（对照），计算相对凝乳酶活力。

1.2.9 脱脂乳浓度对凝乳酶活力的影响分别调整脱脂乳的浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/100 ml，测定酶液在不同浓度脱脂乳液中的凝乳活力，以获得的最高凝乳酶活力为100%（对照），计算相对凝乳酶活力。

1.2.10 金属离子对凝乳酶活力的影响在脱脂乳中分别加入MnSO4、MgSO4、CuSO4、KCl、NaCl、SnCl2，使其终浓度为1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L，加酶后在室温下放置40min，测定凝乳酶活力，以未添加金属离子酶液的凝乳酶活力为100%（对照），计算相对凝乳酶活力。

2 结果与分析

2.1 反应温度对凝乳酶活力的影响（见图1）

图1 反应温度对凝乳酶活力的影响

从图1可以看出，随着温度的升高，相对凝乳酶活力逐渐增加，温度达75℃时，相对凝乳酶活力达到最高值837.20%，随着温度的进一步升高，相对凝乳酶活力急剧下降，在80℃时降为91.98%，在85℃时，酶蛋白完全变性，已无凝乳酶活力。所以，凝乳酶的最适温度是75℃，随着温度的升高，活力逐渐减低直至失活。

2.2 凝乳酶的热稳定性（见图2）

图2 凝乳酶的热稳定性

从图2可以看出，在55℃时，随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力逐渐增大，当保温30min时，相对凝乳酶活力达到最大值218.22%，随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力逐渐下降，保温60 min时相对凝乳酶活力最低；在65℃时，随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力逐渐增大，当保温10min时，相对凝乳酶活力达到最大值181.41%，之后随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力逐渐下降，保温60 min时降到最低；在70℃时，随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力持续下降，保温20 min时，凝乳酶完全失活；在35℃～45℃，随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力缓慢增大且较稳定。综上所述，凝乳酶在35℃～45℃稳定性较好。

2.3 pH值对凝乳酶活力的影响（见图3）

图3 pH值对凝乳酶活力的影响

由图3可以看出，随着pH值的增大，相对凝乳酶活力先增大，pH值为6.0时，相对凝乳酶活力达最大值100%。之后，随着pH值的增大，相对凝乳酶活力下降。有研究显示，酸性环境对凝乳酶起促进作用的原因是pH值降低，导致酪蛋白疏水性增加，胶束易发生解离，从而促进酪蛋白聚集产生凝乳[8]。由上可知，凝乳酶的最适pH值为6.0。

2.4 凝乳酶的pH稳定性（见图4）

图4 不同pH值下凝乳酶的稳定性

由图4可以看出，随着pH值的增大，相对凝乳酶活力逐渐增大，当pH值为8.5时，相对凝乳酶活力达到最大值100.04%，之后随着pH值的增大，相对凝乳酶活力逐渐下降。在pH值为7.0～10.0时，凝乳活力能保持在80%以上。

2.5 脱脂乳浓度对凝乳酶活力的影响（见图5）

由图5可以看出，随着脱脂乳浓度的增加，凝乳酶活力迅速增大，当脱脂乳浓度达10.0%时，相对凝乳酶活力达99.17%，之后趋于稳定，只有小幅度增加，脱脂乳浓度为20.0%时，凝乳酶活力达到最大值，为100%。

2.6 金属离子对凝乳酶活性的影响（见图6）

由图6可知，一定浓度的Mn2+、Mg2+、Na+对凝乳酶的凝乳活力有促进作用，其中Na+对凝乳酶的凝乳活力有显著的促进作用，K+、Sn2+、Cu2+对凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。高岩等[9]研究表明，Mn2+、Mg2+、Ca2+对该酶的凝乳活力有明显的促进作用，而Zn2+、Cu2+对其凝乳活力有抑制作用。

图5 脱脂乳浓度对凝乳酶活性的影响

图6 金属离子对凝乳酶活性的影响

3 结论

研究表明，米黑毛霉凝乳酶最适反应温度为75℃；在35℃～45℃时凝乳酶热稳定性较好，70℃时，随着保温时间的延长，相对凝乳酶活力逐渐下降，到20 min时完全失活；米黑毛霉凝乳酶的最适pH值为6.0，在pH值为7.0～10.0时，凝乳酶较稳定；脱脂乳浓度为20.0%时，凝乳酶活力达到最大值；Mn2+、Mg2+、Na+对凝乳酶的凝乳活力有促进作用，其中Na+对凝乳酶的凝乳活力有显著的促进作用，K+、Sn2+、Cu2+对凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。

[1]周俊清，林亲录.微生物源凝乳酶的研究进展[J].中国食品添加剂，2004，2（4）：6-9.

[2]姜峰，张兰威.我国凝乳酶特性及其替代品的研究现状[J].食品研究与开发，2003，24（6）：3-6.

[3]甘伯中，高维东，丁福军，等.微生物凝乳酶固体发酵条件的研究[J].食品工业科技，2008，29（4）：196-198.

[4]高维东，甘伯中，丁福军，等.微小毛霉凝乳酶的酶学性质研究[J].食品科学，2010，31（3）：185-188.

[5]潘道东，韩玲玲.根霉凝乳酶的分离纯化及其酶学特性研究[J].中国食品学报，2011，11（2）：53-58.

[6]Arima K，Shiniter I，Gakuzo T.Milk-clott ing enzymes from microorganism.part I：screening test and identification of potent fungus[J].Agricultural and Biologi cal Chemistry，1967，31（5）：540-545.

[7]钱世钧，张纯青.微小毛霉凝乳酶的纯化和性质研究[J].微生物学报，1989，29（4）：272－277.

[8]薛璐，陈历俊，姜铁民，等.江米酒凝乳酶酶学特性的研究[J].食品科学，2008，29（4）：259-262.

[9]高岩，王景会，李玉秋，等.枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质[J].吉林农业大学学报，2012，34（4）：385-390.

（*通讯作者：张卫兵）

G424.31

B

1671-1246（2017）13-0105-03

注：本文系甘肃省自然基金（1606RJZA079）；国家自然科学基金项目（31560442）；甘肃农业大学青年导师扶持基金（GAU-QNDS-201502）