莪术不同炮制品中倍半萜及姜黄素类成分的比较

刘会珍， 陆兔林,2* ， 毛春芹， 季 德,2， 李 林， 王若衡

(1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210023)

莪术为姜科植物蓬莪术CurcumaphaeocaulisValeton、广西莪术CurcumakwangsiensisS.G.Lee etl.F.Liang或温郁金CurcumawenyujinY·H·Chen et C·Ling的干燥根茎[1]，具有破气行血、消积止痛的功效和抗癌、抗病毒、抗炎、抗凝血、抗氧化和保肝等生理作用。临床常用饮片有生莪术、醋炙莪术和醋煮莪术，生莪术行气消积力强，醋制后主入肝经血分，增强散瘀止痛作用，疗效显著[2-3]。莪术中的主要活性成分包括以莪术二酮、吉马酮等为代表的倍半萜类成分[4-8]，以及姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素为代表的姜黄素类成分(结构见图1)。根据文献报道莪术中的倍半萜类具有抗病毒和抗肿瘤活性[9]。药理研究表明莪术二酮具有显著抗凝血和抗血栓形成作用[10]，是莪术中的主要活性成分；吉马酮(牻牛儿酮)性质稳定，且具有抗肿瘤等方面的活性[11]，是《中国药典》2010年版中莪术薄层鉴别的指标性成分。同时莪术中的姜黄素类成分也具有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等广泛的药理活性[12-13], 且毒性低。因此，仅以倍半萜类成分或姜黄素类成分作为莪术测定的指标是不完善的，本实验建立了HPLC-DAD法同时测定莪术不同炮制品中的倍半萜及姜黄素类成分，并比较醋制前后这两大类活性成分的变化，对揭示中药炮制内涵，制定醋莪术加工炮制规范和饮片质量标准具有重大意义。

图1 莪术中倍半萜及姜黄素类成分的化学结构

1 仪器与材料

Agilent1200型高效液相色谱仪(包括在线脱气系统、双元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)，KQ-500E型医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)，Mettler AG285电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)，FA1104型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司)。Milli-Q超纯水，乙腈为色谱纯，甲酸(分析纯，南京试剂厂)。甲醇(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。

莪术二酮(批号13657-68-6，上海沪云医药开发有限公司)；吉马酮对照品(中国食品药品检定研究院，批号111665-200902)；双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素(南京泽朗医药科技有限公司，供含量测定用)；姜黄素( 中国食品药品检定研究院，批号110823-200603)。

莪术药材购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，均来源于其主产地(浙江、广西、四川)，经南京中医药大学药学院巢建国教授鉴定，分别为姜科植物温郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling、广西莪术CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang及蓬莪术CurcumaphaeocaulisVal.的干燥根茎。

根据《中国药典》2010年版莪术饮片制法项下制得生莪术饮片、醋制莪术饮片和醋煮莪术饮片。样品来源及品种见表1。

表1 样品来源及鉴定结果

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 生饮片 取原药材, 大小分档, 洗净, 剪去须根,蒸制透心，趁热切薄片, 干燥, 筛去碎屑作为生品(饮片)。

2.1.2 醋炙饮片 取生品(饮片), 加定量米醋拌匀,稍闷润, 待醋汁被吸尽后, 置炒制容器内, 用文火加热,炒至微黄色, 略带焦斑时, 取出, 放凉。每100 kg莪术用米醋20 kg。

2.1.3 醋煮饮片 取原药材置煮制容器内, 加米醋及适量水浸没, 用文火煮至醋汁被吸尽, 内无白心时,取出, 稍晾, 切薄片, 干燥。每100 kg莪术用米醋20 kg。

2.2 色谱条件 Hanbon ODS-2 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.05%甲酸乙腈(A)-0.05%甲酸水(B)，梯度洗脱(0～20 min，45%～55% A；20～40 min，55%～75%A;40～50 min，75%～90%A；50～65 min，90%～100%A)，下一个循环前用45%的乙腈平衡10 min；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃，检测波长216 nm和430 nm，进样量20 μL。色谱图见图2。

图2 对照品(A)及莪术饮片(B)、醋炙饮片(C)和醋煮饮片(D)的高效液相色谱图

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取莪术二酮、吉马酮、姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素对照品适量，加甲醇分别制成单个对照品贮备液。分别精密取各贮备液适量，配制成混合对照品贮备液，以上5个化合物在混合对照品贮备液中的质量浓度分别为0.167 4、 0.040 6、0.017 3、0.019 3、0.001 1 mg/mL。

2.3.2 供试品溶液的制备 莪术饮片粉碎过三号筛(50目)，取粉末0.5 g，精密称定，加50 mL 90%乙醇，索氏回流提取至提取溶剂无色，50 ℃水浴挥干溶剂，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL，摇匀，过微孔滤膜(0.45 μm)，20 μL进样。

2.4 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液 1、6、10、16、20 μL进样分析，每个体积进样2次，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积平均值对质量浓度进行线性回归，得回归方程分别为：莪术二酮y=478.82x+0.162 8，r=1.000 0；吉马酮y=2 049.8x-3.217 8，r=1.000 0；双去甲氧基姜黄素y=4 890.7x-2.220 4，r=1.000 0；去甲氧基姜黄素y=5 301.1x-5.724 4，r=1.000 0；姜黄素y=4 660.8x-5.571，r=1.000 0；结果表明莪术二酮在8.37～167.5 μg/mL、吉马酮在2.03～40.59 μg/mL、双去甲氧基姜黄素在0.23～1.14 μg/mL、去甲氧基姜黄素在0.99～19.8 μg/mL、姜黄素在0.89～17.8 μg/mL线性关系良好。

2.5 精密度试验 取上述混合对照品溶液，于同一天内连续进样6次，每次进样10 μL，测定莪术二酮、吉马酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的峰面积值，计算得其RSD值，分别为0.74%、1.22%、1.56%、1.12%和0.68%。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液20 μL分别于制备后0、6、12、 24、 48 h进样，测定莪术二酮、吉马酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的峰面积，RSD值分别为1.72%、0.62%、2.47%、1.34%、1.33%。表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.7 重复性试验 称取莪术粉末(批号120506)约0.5 g，共6份，精密称定，按“2.3.2”项下制备样品，测定莪术二酮、吉马酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的平均含有量为0.377 6、0.300 6、0.006 5、0.1219、0.129 4 mg/g，RSD值分别为4.2%、6.5%、1.5%、1.4%、1.5%。

2.8 准确度试验 精密称取已知5个成分含有量的莪术粉末(批号120506)约0.25 g，共9份。根据样品中各成分量的80%、100%与120%，分别加入对照品溶液各3份，按“2.3.2”项下方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件进行HPLC分析，根据测得量和加入量计算回收率。结果莪术二酮、吉马酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的加样回收率分别为103.4%、100.1%、98.3%、96.8%、100.5%，RSD值分别为0.3%、1.1%、1.9%、1.3%、2.2%。

2.9 样品测定 取各批次莪术生饮片、醋炙饮片和醋煮饮片样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，每份样品平行3份，按上述色谱条件测定，计算5种成分的平均质量分数，结果见表2。

表2 莪术不同炮制品中倍半萜和姜黄素类成分的测定(n=3)

与相应生品相比，醋炙饮片和醋煮饮片中这5个活性成分的量均有不同程度的下降，样品CIK110522中双去甲氧基姜黄素的量较其相应生品CK110522有所升高,与整体变化趋势稍有差异。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 鉴于待测样品中包含两种不同类型的成分，本实验首先考察了两种不同的流动相系统(甲醇-水和乙腈-水)进行梯度洗脱，结果甲醇-水系统梯度洗脱无法使倍半萜类和姜黄素类成分分离，且峰形不好；乙腈-水系统可以使倍半萜类(莪术二酮、吉马酮)分离，但无法使姜黄素类成分分离良好；查阅文献后，在乙腈和水中分别加酸以使姜黄素类成分达到基线分离，分别考察了不同种类的酸和加入酸的比例，结果0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水系统梯度洗脱，可以使姜黄素类成分达到基线分离并不对倍半萜类(莪术二酮、吉马酮)产生影响。同时对样品进行全波长扫描，最终确定莪术二酮、吉马酮的检测波长为216 nm，姜黄素类成分的检测波长为430 nm。

3.2 供试品溶液的制备 在供试品溶液的制备过程中，考察了不同的提取溶剂(乙醚、甲醇、无水乙醇和90%乙醇)和不同的提取方法(超声提取和索氏回流提取)，结果发现90%乙醇索氏回流提取至提取溶剂无色，提取效果较好，这两类成分均能得到最佳提取且色谱峰峰形较好。

3.3 小结 醋炙莪术饮片、醋煮莪术饮片中莪术醇、吉马酮和姜黄素类化合物的量均低于生莪术饮片。莪术二酮和吉马酮为倍半萜类化合物，熔沸点较低，醋炙与醋煮过程中加热易造成这些成分的挥发，故炮制后含有量降低。此外，莪术二酮在加热条件下发生热重排反应转化成莪术醇[14]，但相同条件下莪术醇不能转化成莪术二酮，可能是莪术二酮炮制后含有量降低的原因之一。姜黄素类性质不稳定，在加热和酸性条件下可能发生降解而导致含有量降低，降解过程及规律有待进一步研究。

此外， 批号CIK110522样品中双去甲氧基姜黄素的变化趋势出现差异，其原因可能是炮制过程中，人为因素的影响，如润制时间、炒制时间、炒制程度、煮法的加水量和煮制时间的掌握等，可能会影响测定结果，制定规范化、标准化的炮制操作规程尤为必要。本研究为制定莪术炮制规范及饮片质量标准提供了参考。

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