商陆皂苷甲急性毒性与利尿作用研究*

崔楠楠,孟祥龙,马俊楠,李坤,张朔生

(1.湖北中医药大学药学院,武汉 430065;2.山西中医学院中药学院,太原 030024)

·药物研究·

商陆皂苷甲急性毒性与利尿作用研究*

崔楠楠1,2,孟祥龙1,2,马俊楠2,李坤2,张朔生2

(1.湖北中医药大学药学院,武汉 430065;2.山西中医学院中药学院,太原 030024)

目的 了解商陆皂苷甲对小鼠急性毒性特点,观察其对大鼠的利尿作用。方法向小鼠腹腔注射不同浓度的商陆皂苷甲,观察给药后小鼠毒性反应,测定急性毒性的相关参数。向水负荷状态大鼠腹腔注射不同剂量商陆皂苷甲,测定给药后连续6 h总尿量。结果Bliss法计算商陆皂苷甲LD50为26.19 mg·kg-1,95%可信区间为23.11～29.85 mg·kg-1。随着商陆皂苷甲浓度的增加,小鼠的毒性反应表现越明显,且小鼠的死亡数随之增加,空白对照组小鼠无异常反应。高剂量组大鼠尿量与阴性对照组差异有统计学意义,而中、低剂量组差异无统计学意义。结论商陆皂苷甲单次腹腔注射对小鼠有一定的毒性且商陆皂苷甲高剂量对大鼠有利尿作用。

商陆皂苷甲;毒性,急性;利尿作用

商陆为商陆科植物商陆Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陆P.americanaL.的干燥根。该药味苦性寒,有毒,归肺、脾、肾、大肠经,具有逐水消肿、通利二便、解毒散结等功能[1]。商陆皂苷甲(esculentoside A, EsA)是从商陆中提取的一种三萜类皂苷,是商陆中含量最高的皂苷[2]。关于商陆主要毒性成分的研究,目前尚无统一结论,主要有以下几个观点:有报道称EsA和组胺是商陆中的主要毒性成分[3],EsA又被称为商陆毒素;孙红祥等[4]通过实验发现商陆中毒性成分可能不限于已知的商陆毒素和组胺,认为其毒性成分尚待研究;马杰等[5]根据商陆醋炙后EsA含量大幅增加的结果,进一步推测EsA不能等同于商陆毒素,它并不是一种引起商陆毒性反应的主要成分。同时EsA作为商陆皂苷的主要成分,与商陆皂苷活性相似,具有显著的抗炎、免疫抑制、诱生γ-干扰素、增强白细胞吞噬功能、提高DNA合成率等作用[6],是商陆扶正固本作用的有效成分之一[7]。但是对商陆逐水消肿、通利二便作用的研究,目前仅限于对商陆总提物(水煎剂、醇浸膏)或活性部位的简单利尿实验研究,对于其主要成分EsA是否具有利尿作用的研究笔者尚未见文献报道。基于此,很有必要对EsA的毒性及利尿作用进行研究,这将有助于了解商陆的毒性,探明商陆利尿作用的物质基础,为EsA“量-效-毒”关系的建立以及商陆临床安全有效使用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种健康小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量18～22 g,由山西省肿瘤研究所提供,动物生产许可证号:SCXK(晋)2012-0001;SD健康雄性大鼠,SPF级,体质量180～220 g,由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供,动物生产许可证号:SCXK(京) 2009-0017。

1.2 受试药物 EsA粉剂(成都曼思特生物科技有限公司,纯度:90%,批号:MUST-12091702);氢氯噻嗪片(山西利丰华瑞制药有限责任公司,批号:20120202); 0.9%氯化钠溶液(石家庄四药有限公司,批号: 130311710);EsA粉剂及氢氯噻嗪均用0.9%氯化钠注射液配制成各给药浓度。

1.3 仪器 美国奥豪斯(OHAUS)ARB120电子天平;德国LEICA EG 1150H自动石蜡包埋机;德国LEICA RM 2235半自动轮转切片机;日本OLYMPUS BX51型显微镜。

1.4 小鼠急性毒性实验 正式试验前以少量小鼠进行EsA毒性的预试验,得到EsA的LD0及LD100。根据预实验的结果,将小鼠按体质量随机分为7组,每组10只,雌雄各半。除空白对照组给予等量的0.9%氯化钠溶液外,其余6组给予不同浓度受试药物,组间比为1∶0.80,给药剂量分别为42.00,33.60,26.88,21.50,17.20, 13.76 mg·kg-1。试验前禁食不禁水14 h,给药体积为0.2 mL·(10 g)-1,腹腔注射1次。动物给药后即刻进食,给药当天连续多次观察,尤其是给药后4 h密切观察动物的毒性反应(一般表现、呼吸、活动及有无惊厥),中毒症状发生的时间、持续时间,恢复情况,逐日记录动物死亡时间,连续观察14 d,并在给药第1天,第3天,第7天,第14天称量小鼠体质量。对死亡动物进行大体解剖,对EsA最高剂量组死亡动物取脑、肝、肾、胃、大肠、小肠等主要脏器进行组织病理学检查。观察周期结束后,根据各组死亡情况,采用Bliss法计算LD50。

1.5 对水负荷状态下大鼠的利尿作用 实验前24 h,大鼠禁食不禁水,按25 mL·kg-1剂量灌胃纯化水,收集2 h内尿量,选取2 h内排尿量达到灌胃量的40%以上的大鼠作为利尿实验对象。将通过筛选的大鼠50只,随机分为5组,分别为:阴性对照组、氢氯噻嗪对照组(氢氯噻嗪0.4 mg·kg-1[8])、EsA高剂量组(5.2 mg·kg-1)、EsA中剂量组(2.6 mg·kg-1)、EsA低剂量组(1.3 mg·kg-1),每组10只。将筛选出的大鼠按25 mL·kg-1剂量灌胃纯化水,手轻压大鼠下腹部使其排尽余尿。30 min后,阴性对照组腹腔注射0. 9%氯化钠溶液,其他4组腹腔注射各受试药物,给药体积均为20 mL·kg-1。立即放入代谢笼内(每笼1只)。每2 h收集尿液1次,连续收集6 h。记录每2 h动物的尿量,计算6 h总排尿量。

1.6 统计学方法 采用PEMS 3.0对半数致死量数据进行分析统计,计算LD50(Bliss法)。数据以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS17.0版统计软件进行数据处理,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性实验结果

2.1.1 一般症状观察 空白对照组动物给药后无明显异常变化,最高剂量组动物死亡多发生在给药后1～4 h内,次高剂量组动物死亡多发生在给药后3～8 h内,其余各组死亡多发生在给药后5～12 h内。剂量较高组的动物在给药后立即表现出狂躁不安,互相撕咬,随即腹部贴地式摇摆前进,行动迟缓,最后行为转为怠动,低剂量组动物给药后不出现狂躁等现象,仅表现为怠动。所有组动物死亡时均呈趴状,口鼻及尾巴青紫。给药后第3天动物行为活动基本恢复正常。

2.1.2 药物对体质量的影响 由于42.00, 33.60 mg·kg-1剂量组小鼠给药第1天时,已全部死亡和仅存活1只,无法考察这一剂量对体质量的影响,因此仅考察其余剂量组药物对体质量的影响。给药第3天,除EsA 26.88 mg·kg-1组的小鼠体质量略有下降之外,其余组小鼠体质量均升高,但升高的速率有一定差别,升高速率从大到小依次为:空白对照组＞EsA 13.76 mg·kg-1组＞EsA 17.20 mg·kg-1组＞EsA 21.50 mg·kg-1组＞EsA 26.88 mg·kg-1组。给药第14天,各组小鼠体质量均有所增长。各组小鼠在观察期结束时平均体质量从大到小依次为:空白对照组＞EsA 13.76 mg·kg-组＞EsA 17.20 mg·kg-1组＞EsA 21.50 mg·kg-1组＞EsA 26.88 mg·kg-1组。体质量增加的具体情况见图1。

2.1.3 靶器官鉴定 对EsA 42.00 mg·kg-1组死亡的动物取脑、肝、肾、胃、大肠、小肠等主要脏器进行组织病理学检查,见图2。由图2可见,EsA造成小鼠肾脏肾髓质处小管上皮细胞核浓缩、瘀血性出血(图2A, 2B);对肝脏的影响表现为肝窦扩张、瘀血(图2C, 2D),肝细胞肿胀、轻度水样变性(图2E)以及弥散性肝细胞核损伤(图2F)。其余脏器未见明显病理变化。图2G,2H分别为空白对照组小鼠的正常肾脏和肝脏显微图。

2.1.4 LD50结果 给药后观察14 d,记录小鼠死亡情况,结果见表1。结果为:LD50=26.19 mg·kg-1,95%可信区间为23.11～29.85 mg·kg-1。

1.给药第3天;2.给药第5天;3.给药第7天;4.给药第14天图1 不同给药浓度对小鼠体质量增加量的影响1.3 d after treatment;2.5 d after treatment;3.7 d after treatment;4.14 d after treatmentFig.1 Effect of different dose on the increase of body weight of mice

2.2 对水负荷状态下大鼠的利尿作用 测量给药后大鼠连续6 h的尿量,比较各组总尿量:EsA高剂量组与阴性对照组及EsA中、低剂量组间差异有统计学意义,与氢氯噻嗪对照组比较差异无统计学意义;EsA中、低剂量组均与阴性对照组差异无统计学意义,且EsA中、低剂量组之间也差异无统计学意义。比较不同时间段的尿量发现:EsA高剂量组在0～2 h及～4 h的尿量均与阴性对照组差异有统计学意义,氢氯噻嗪对照组仅在0～2 h与其差异有统计学意义,EsA中、低剂量组在3个时段与其均差异无统计学意义。见表2。

3 讨论

3.1 小鼠急性毒性实验 EsA小鼠急性毒性实验脏器病理切片示,EsA主要对肝、肾产生不同程度损伤。此结论与张茜等[9]研究认为大剂量EsA可能对肝肾具有一定毒性作用的观点相吻合。

从EsA 42.0 mg·kg-1组小鼠给药后表现出的狂躁、互相撕咬等行为推测EsA可能对小鼠中枢神经系统有影响。有报道称商陆临床中毒症状主要表现为胃肠道反应,如恶心呕吐、腹痛腹泻,严重者可出现胃肠道黏膜糜烂、溃疡及出血等[10]。EsA作为商陆主要成分之一,小鼠在给予EsA后体质量较空白对照组增长缓慢,推测EsA可能会影响胃肠功能。从各组小鼠在观察期结束时平均体质量的排序可见,EsA剂量越大,对小鼠体质量的抑制作用越大,呈现一定量效关系。

3.2 对水负荷状态下大鼠的利尿实验 本项利尿实验中EsA高剂量组的剂量定为LD50的1/5,中剂量组为LD50的1/10,低剂量组为LD50的1/20。

本实验结果表明EsA高剂量有明显的利尿作用,且利尿作用与中效利尿药氢氯噻嗪作用相当;中、低剂量无利尿作用。同时通过比较不同时段的尿量,得出高剂量组发挥药效主要在给药后4 h内,而阳性对照药氢氯噻嗪主要在给药后2 h内发挥药效。说明高剂量EsA较氢氯噻嗪利尿作用时间更长。

EsA 42.00 mg·kg-1剂量组:A.肾(×100),B.肾(×200),C.肝(×100),D.肝(×200),E.肝(×400),F.肝(×400);空白对照组: G.正常肾(×100),H.正常肝(×100)图2 EsA 42.00 mg·kg-1组和空白对照组小鼠肾脏、肝脏组织病理损伤HE染色Group 42.00 mg·kg-1EsA,A.kidney(×100),B.kidney(×200),C.liver(×100),D.liver(×200),E.liver(×400),F.liver(×400); blank control group:G.normal kidney(×100),H.normal liver(×100)Fig.2 HE staining on pathological injure in group 42.00 mg·kg-1EsA and blank control group of kidney and liver of mice

表1 7组小鼠死亡数量及死亡率比较Tab.1 Comparison of deaths and mortality in seven groups of mice

《中华人民共和国药典》2010年版中规定成人一天服用的商陆用量为3～9 g[1]。根据王铁军等[11]测定的不同地区的商品商陆药材中EsA的含量在0.32%～1.11%,计算得出成人一天服用的商陆中含有EsA量为9.6～99.9 mg,成人按体质量70 kg计算,一天服用的商陆中含有EsA的量0.137～1.427 mg·kg-1。本实验中有明显利尿作用的EsA给药量为5.2 mg·kg-1,按体表面积折算大鼠与人的等效剂量,这一剂量在临床有效剂量范围之内。这就表明,EsA可能是商陆中起利尿作用的主要成分之一。

表2 5组大鼠水负荷状态下尿量比较Tab.2 Comparison of urine volume with water load in five groups of rats ±s

表2 5组大鼠水负荷状态下尿量比较Tab.2 Comparison of urine volume with water load in five groups of rats ±s

与阴性对照组比较,*1P＜0.05Compared with negative control group,*1P＜0.05

组别剂量/ (mg·kg-1)尿量/[mL·(100 g)-1] 0～2 h～4 h～6 h0～6 h阴性对照组…0.774±0.390.449±0.310.349±0.161.569±0.67氢氯噻嗪对照组8.01.867±0.39*10.548±0.230.452±0.282.868±0.67*1EsA高剂量组5.21.190±0.17*10.975±0.31*10.549±0.502.715±0.62*1中剂量组2.60.522±0.270.514±0.330.485±0.261.522±0.65低剂量组1.30.498±0.210.338±0.140.365±0.161.202±0.29 F 37.9647.8970.70014.556

综上所述,本研究提示EsA可能是商陆中起利尿作用的主要成分之一,故《中华人民共和国药典》2010年版通过测定药材中EsA的含量进行商陆质量控制,具有一定的科学性。比较EsA对大鼠利尿作用的有效剂量(5.2 mg·kg-1)与其小鼠LD50(26.19 mg·kg-1),同时考虑大、小鼠的种属差异,EsA利尿作用的有效剂量大于其LD50的1/5。EsA能否作为临床安全使用的利尿药尚待进一步研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:304-305.

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.001

Acute Toxicity Test and Diuresis Effect of Esculentoside A

CUI Nan-nan1,2,MENG Xiang-long1,2,MA Jun-nan2,LI Kun2,ZHANG Shuo-sheng2
(1.College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;2.School of Traditional Chinese Medicine,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030024,China)

Objective To understand the intensity and characteristics of acute toxicity of esculentoside A on mice and measure relevant parameters and observe its diuresis effect on rat.MethodsAfter intraperitoneal injection of different concentrations of esculentoside A to mice,toxic reactions were observed.Rats with water load were intraperitoneally injected with different doses of esculentoside A.Total urine volume in six consecutive hours after the injection was determined.ResultsThe LD50of esculentoside A calculated by Bliss method was 26.19 mg·kg-1,and the 95%confidence interval was 23.11-29.85 mg·kg-1.The mortality and acute toxicity of esculentoside A appeared to be dose-dependent while the blank control group had no abnormal reaction.The urine volume was significantly different between high dose group and the negative control group.No significant difference in urine volume was found between middle and the negative control group,and between low dose group and the negative control group.ConclusionEsculentoside A is poisonous to mice when single dose was intraperitoneally injected, and high dose of esculentoside A has diuresis effect on rat.

Esculentoside A;Toxicity,acute;Diuresis effect

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-0981-04

2013-07-26

2014-02-13

*国家自然科学基金资助项目(81173555)

崔楠楠(1987-),女,山西运城人,在读硕士,研究方向:中药炮制现代研究。电话:(0)18635172585,E-mail: zhe2nan@126.com。

张朔生(1965-),男,山西朔州人,教授,硕士生导师,硕士,研究方向:中药炮制现代研究。电话:0351-2272652, E-mail:zhangshuosheng@aliyun.com。