离子液体作为流动相添加剂在高效液相色谱法分离黄柏碱和木兰花碱中的作用机制*

杨勇，边敏，李伟

(1.南京中医药大学药学院，南京 210046；2.南京工业大学理学院，南京 210009)

离子液体作为流动相添加剂在高效液相色谱法分离黄柏碱和木兰花碱中的作用机制*

杨勇1，边敏2，李伟2

(1.南京中医药大学药学院，南京 210046；2.南京工业大学理学院，南京 210009)

目的 建立黄柏碱与木兰花碱的色谱分离方法,并通过考察各影响因素,探讨离子液体在分离过程中的作用机制。方法以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐为流动相添加剂,用高效液相色谱法分离黄柏碱和木兰花碱,并分别考察流动相pH、离子强度、缓冲溶液种类、离子液体的种类、柱温等影响因素,探讨离子液体在整个分离过程中的作用机制。结果以20 mmol·L-1离子液体作为流动相添加剂等度洗脱即能达到两种生物碱的基线分离。两组分的保留值、分离度及理论板数随着流动相条件的改变而不同。结论离子液体在黄柏碱与木兰花碱的分离过程中以生成中性离子对的作用为主。

离子液体；黄柏碱；木兰花碱；色谱法,高效液相；添加剂；流动相

黄柏碱与木兰花碱是黄柏的主要活性成分,在黄柏药材及相关剂型的鉴别及含量测定中,两者常作为考察的主要指标,要求同时分离测定。用高效液相色谱法(HPLC)同时分离测定两种生物碱的研究报道较少,且采用的方法以梯度洗脱为主［1-2］。这种方法分析周期短,峰型对称,灵敏度好。但基线易漂移,重复性较差,对所用试剂的纯度、黏度、色谱柱等实验条件要求较高。因此在保证分离度、灵敏度的前提下,简便易行的等度洗脱仍然是首选的分离测定方法。采用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate,Bmim BF4)作为流动相添加剂可成功分离生物碱,减少试样的拖尾峰,改善峰形,提高分离效率。与三乙胺(triethylamine, TEA)体系相比,生物碱的保留值降低幅度较小,在相同浓度下,分离效能较高［3］。此外,由于生物碱具有不同的结构及碱性,离子液体作为流动相添加剂在分离过程中的色谱行为不同,分离机制也有所不同。笔者以木兰花碱、黄柏碱为分离研究对象,建立HPLC等度洗脱的分离测定方法,通过考察分离条件及影响因素,探讨离子液体在此分离过程中的作用机制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Shimadzu高效液相色谱系统:LC-20AD泵, SPD-20A检测器,7125进样器,Class-VP色谱工作站。

1.2 试药 标准品黄柏碱(批号:E-0638,纯度> 99%)和木兰花碱(批号:E-0306,纯度>99%)均由上海同田生物技术有限公司提供；离子液体1-丁基-3-甲基咪唑卤化盐［BminX,X=氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)］, Bmim BF4,1-丁基-3-甲基眯唑六氟磷酸盐(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate,Bmim PF6)根据文献报道合成［4-5］,经莫尔法、分光光度法测定纯度> 97%；乙腈(色谱纯,天津康科德公司)；磷酸(优级纯,国药集团化学试剂公司)；实验用水为三蒸水(自制)；黄柏药材购于药材市场,经南京中医药大学药学院刘圣金老师鉴定。

2 方法与结果

2.1 标准溶液的配制 精密称取黄柏碱和木兰花碱标准品适量,置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得含黄柏碱10.1μg·mL-1,木兰花碱10.7μg·mL-1的混合标准溶液,保存于4℃冰箱内。使用前用流动相稀释10倍,经孔径0.45μm滤膜过滤。

2.2 色谱条件 色谱柱:ODS柱(4.6 mm×150 mm, 5μm,Agilent TC-C18),流动相:20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液-乙腈(75∶25,pH4.5),另向流动相中添加2.6 mmol·L-11-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐,流动相使用前经孔径0.45μm滤膜过滤；流速: 1.0 mL·min-1,检测波长:280 nm。色谱图见图1。

图1 两种生物碱的色谱分离图1.黄柏碱;2.木兰花碱Fig.1 Chromatographic of two kinds of alkaloids1.phellodendrine;2.magnoflorine

可见,两种生物碱在给定的色谱条件下得到很好的分离,经计算分离度>1.5,满足分离测定要求。

2.3 影响因素的考察

2.3.1 pH 黄柏碱、木兰花碱属于弱碱［6］,而一般液相色谱柱使用的pH范围为3～7之间。即在工作pH范围内,此类生物碱的一部分以质子化酸为主要存在形式,pH越小,质子化酸的比例越高。

分别调节流动相的pH为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0, 5.5,6.0,6.5,7.0,考察组分容量因子(k′)变化。流动相在不同pH条件下,两组分的保留及变化趋势见图2。

图2 pH对组分保留因子的影响

2.3.2 缓冲溶液的浓度 由于生物碱易质子化,这种质子化过程可能在某一瞬间的局部区域即可发生,质子化过程的不确定性可导致在分离过程中色谱峰的失真。所以,生物碱的液相分离大多在一定浓度的缓冲溶液中进行,且保留行为与缓冲液的浓度相关。实验中分别配制浓度为10～60 mmol·L-1缓冲溶液作流动相,考察组分分离效果。

结果显示,不同浓度的缓冲溶液作流动相,离子强度不同,分离效率亦不同。当浓度为20 mmol·L-1时,各组分即可达到基线分离,且峰型良好。随着缓冲溶液浓度的增大,离子强度的增大,各组分的分离效率显著提高。造成这种现象的原因是由于离子强度的增大,使生物碱极性基团之间的作用力减弱,产生促溶效应,导致色谱柱饱和容量增加,改善分离效果及色谱峰型［7-8］。

但同时也需要注意,离子强度过高,对液相系统的腐蚀损坏程度也随之增大。因此当分离度达到要求时,离子强度不宜过高。故实验采用的缓冲溶液浓度为20 mmol·L-1。

2.3.3 缓冲溶液的种类 分别配制20 mmol·L-1醋酸铵与磷酸二氢钠缓冲溶液作流动相,考察缓冲溶液种类对分离的影响。结果显示在相同条件下,醋酸铵缓冲液的分离效果较差,见图3。

图3 以醋酸铵缓冲溶液作流动相的HPLC色谱图1.黄柏碱;2.木兰花碱Fig.3 HPLC chromatogram of alkaloids with mobile phase containing amm onium acetate buffer1.phellodendrine;2.magnoflorine

2.3.5 柱温 分别设定柱温为298,303,308,313℃,考察柱温与组分保留的关系。结果柱温为298,303, 308,313℃时,黄柏碱lg k′分别为0.709 3,0.698 2, 0.691 4,0.672 3；木兰花碱的lg k′分别为0.841 4, 0.835 5,0.829 7,0.811 1。

表1 不同离子液体作添加剂分离黄柏碱与木兰花碱的色谱参数Tab.1 Chrom atographic parameters for separating phellodendrine and magnoflorine with different ionic liquid as additives

由范特霍夫方程可得容量因子的温度效应符合如下线性关系:

2.4 黄柏药材中两组分的分离 将流动相流速调至0.7 mL·min-1,其他同“2.2”项色谱条件,对黄柏药材中的两组分进行分离,进一步验证该分离方法的可行性。精密称定黄柏药材粉末2 g,加甲醇50 mL,超声处理30 min,冷却后摇匀静置,取上清液,使用前经孔径0.45μm滤膜过滤,即得供试液,分离色谱图见图4。

图4 黄柏的色谱分离图1.黄柏碱;2.木兰花碱Fig.4 Chromatograms of phellodendron amurense1.phellodendrine;2.magnoflorine

可见,两组分在该色谱条件下能够达到基线分离,能够满足分离测定的要求。

3 讨论

总之,以离子液体为流动相添加剂,等度洗脱即能实现两种生物碱的基线分离。影响因素的考察结果表明,随着流动相pH升高,组分的保留值增大；流动相的离子强度增强、缓冲溶液的缓冲能力降低,组分的分离度增大；离子液体的离液序列升高,柱效增大；组分的保留值与柱温满足范特霍夫线性方程,且此法使黄柏药材中的两种生物碱达到基线分离,满足分离测定要求。以上结果均一致表明,在此类生物碱的分离过程中,离子液体在此分离过程中的作用以中性离子对试剂为主。当分离条件不同,组分的保留与分离效果也会相应改变。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.028

Mechanism of Ionic Liquids as a Mobile Phase Additives on the Separation of Phellodendrine and Magnoflorine by HPLC

YANG Yong1,BIAN Min2,LIWei2
(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China;2.College of Science,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China)

Objective The chromatographic separation of phellodendrine and magnoflorine was established,and the mechanism of ionic liquid in the process was studied by investigating influencing factors.MethodsPhellodendrine and magnoflorine were isolated by HPLC with 1-butyl-3-methyl imidazole four fluorine boric acid as a mobile phase additive,and mobile phase pH,ionic strength,buffer solution,ionic liquids and column temperaturewere allstudied by investigating the effect of ionic liquid in the process.ResultsIt was shown that the analytes were separated at baseline with a mobile phase containing ionic liquid under 20 mmol·L-1isocratic elution.The retention value,separation and number of theoretical plates varied with the change ofmobile phase.ConclusionIt is clarified that ionic liquid mainly acts as neutral ion pair in the separation of phellodendrine and magnoflorine.

Ionic liquids;Phellodendrine;Magnoflorine;Chromatography,high performance liquid;Additive;Mobile phase

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0096-04

2013-05-07

2013-07-29

*国家自然科学基金资助项目(81073023)

杨勇(1979-),男,陕西韩城人,讲师,硕士,主要从事中药质量控制与管理工作。电话：(0)13770794523,E-mail：leaoyang@163.com。