HPLC 法同时测定大鼠肝微粒中原儿茶酸和香草酸的含量

代 晶，石明芯，王佳慧

儿茶酚氧甲基转移酶(COMT)是生物体内重要的Ⅱ相代谢酶，能够通过S-腺苷-L-甲硫氨酸使药物发生甲基化反应，对其药代动力学和药效学产生影响。除此以外，其活性高低还与帕金森、精神分裂症、抑郁症、乳腺癌、白癜风等疾病存在相关性［1-3］。因此，测定COMT活性对于研究药物与COMT的关系，诊断和治疗某些疾病具有重要意义。COMT在肝中活性最高，而肝微粒体中含有丰富的Ⅱ相代谢酶，为了测定肝微粒体中COMT的活性，本试验建立了同时测定COMT的底物(原儿茶酸)和其代谢产物(香草酸)含量的HPLC法。该方法简单、灵敏、准确，可为COMT相关研究提供有效的分析手段。

1 材料

1.1 试剂 绿原酸(批号CAA-111101)购自成都天源天然产物有限公司;原儿茶酸(批号 Y-031-132012)和香草酸(批号X-030-120316)购自成都瑞芬思生物科技有限公司;甲醇(Dikma公司，色谱纯)，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Ultimate3000型高效液相色谱仪(美国Dionex公司):包括 P680泵、ASI-100自动进样器、UV1700型检测器，TC100柱温箱，Chromeleon工作站。

1.3 实验动物 健康成年的SD大鼠8只，雌雄各半，体重250～300 g，购自四川大学华西实验动物中心，合格证号SYXK(川)2008-113。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制 分别取原儿茶酸、香草酸对照品适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为1.0、0.75 mg/ml的贮备液。取上述贮备液适量，用甲醇稀释成系列浓度的对照品溶液，其中原儿茶酸的质量浓度分别为200、100、50、20、10、5 μg/ml，香草酸分别为 150、75、37.5、15、7.5、3.75 μg/ml。取绿原酸(内标)对照品适量，用甲醇稀释成质量浓度为200 μg/ml的溶液。上述溶液置4℃冰箱，备用。

2.2 肝微粒体的制备与测定 参考文献［4］的方法制备大鼠肝微粒，并测定蛋白浓度。

2.3 色谱条件 色谱柱:Welchrom C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱 温 30 ℃，流 速 1.0 ml/min;流动相为甲醇∶0.1%磷酸(25∶75);原儿茶酸和香草酸检测波长为260 nm，内标检测波长为326 nm。

2.4 样品前处理方法 取原儿茶酸、香草酸对照品溶液50 μl，挥干溶剂，加入肝微粒体和 0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)溶液，使终体积为 0.5 ml，蛋白的终浓度为0.5 mg/ml，制成离体肝微粒样品溶液。

比较3种前处理方法。方法1:向样品溶液中加入2.0 ml甲醇和50 μl内标溶液，涡旋沉淀蛋白3 min。然后以12 000 r/min离心10 min，取出全部上清液，于50℃氮气流下吹干溶剂，残留物用100 μl流动相溶解，13 500 r/min离心10 min，取出上清液20 μl进样分析，计算提取回收率。

方法2:向样品溶液加入2.0 ml乙酸乙酯和10 μl内标溶液，涡旋萃取 3 min，静止 3 min，取出全部有机层，于50℃氮气流下吹干溶剂，残留物用100 μl流动相溶解，取出 20 μl进样分析。

方法 3:向样品溶液中依次加入 50 μl(或100 μl)盐酸(1 mol/L)和 2.0 ml乙酸乙酯，其余操作参照“方法2”。

结果显示，“方法3”中 HCl为50 μl时，原儿茶酸和香草酸的提取率最大(表1)，故本试验选择该方法作为样品前处理方法。

表1 3种前处理方法提取回收率结果比较(%)

2.5 系统适用性试验 分别取空白肝微粒体、空白肝微粒体加各对照品溶液，参照“2.3”和“2.4”项下方法处理和分析样品。在此条件下，原儿茶酸、内标和香草酸保留时间分别为 7.0、9.9 和 14.0 min，理论塔板数分别大于8100、7400和11 000。各成分达基线分离，内源性物质无干扰(图1)。

图1 空白肝微粒体(A)和空白肝微粒体加对照品(B)的高效液相色谱1：原儿茶酸;2：绿原酸（内标）;3：香草酸

2.6 线性关系试验 分别取原儿茶酸和香草酸系列标准溶液各50 μl挥干溶剂后，加入肝微粒溶液，每个浓度样品一式3份，参照“2.3”和“2.4”项下方法处理和分析样品。以各底物峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标(Y)，以各底物浓度作为横坐标(X)进行线性回归。同时以信噪比≥10计算定量下限(LLOQ)，以信噪比≥3计算检测限(LOD)。结果显示，原儿茶酸和香草酸分别在 0.5 ～20 μg/ml和0.375 ～15 μg/ml范围内线性关系良好，回归方程分别是 Y=0.1268X-0.0856 和 Y=0.0363X-0.0034;相关系数依次是 0.9995 和 0.9999;LLOQ分 别 为 0.05 μg/ml和 0.03 μg/ml;LOD 均 为0.01 μg/ml。

2.7 精密度和回收率试验 制备高、中、低3个浓度的质控样品溶液，每一浓度平行制备5份，参照“2.3”和“2.4”项下方法处理和分析样品。1 d内进样分析，计算日内精密度，连续测定3 d，计算日间精密度。将测定的底物与内标峰面积之比代入回归方程，计算方法回收率。再取同等浓度的各底物和内标对照品溶液，直接挥干溶剂，流动相溶解后进样分析，将肝微粒体内的底物的标峰面积与对照峰面积进行比较，计算提取回收率。结果见表2。

表2 精密度和回收率试验结果(n=5)

2.8 稳定性试验 分别将低、中、高3个浓度的质控溶液置于室温和-20℃冰箱中保存。置于室温的样品分别于24 h和48 h后进行测定，置于-20℃冰箱中的样品分别于3 d和7 d后测定含量。结果显示，置于室温的原儿茶酸和香草酸含量的RSD＜2.4% 和 RSD ＜3.2%，置于冰箱的RSD＜9.7%和RSD% ＜10.8%。表明质控样品在室温48 h内稳定，在-20℃冰箱7 d内稳定。

3 讨论

关于COMT活性测定方法主要包括HPLC(UV［5］、ECD［6］、FD［7］法和 GC-MS 法［8］等。ECD 法灵敏度较高，但检测器并不普及;FD法和GC-MS法需要对样品进行柱前衍生化处理，操作较麻烦。有学者采用HPLC-UV法测定COMT活性，但其采用直接沉淀蛋白方法处理样品，以外标法定量。而本试验将样品酸化提取后再浓缩，这种方法将样品处理得较干净，极大地减少了内源性物质的干扰，避免了残留蛋白对色谱柱的污染，而且提高了检测灵敏度。同时，为了减小操作和仪器误差给结果带来的影响，本试验以内标法进行定量，试验表明绿原酸与待测物提取率接近，色谱行为相似，适合于原儿茶酸和香草酸的测定。总之，本试验建立的方法简单、灵敏、准确，适合于大鼠肝微粒体中COMT活性测定及相关研究。

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