池蝶蚌线粒体基因组全序列分析

盛军庆 林巧惠 王军花 彭 扣 洪一江



池蝶蚌线粒体基因组全序列分析

盛军庆 林巧惠 王军花 彭 扣 洪一江

(南昌大学生命科学与食品工程学院, 南昌 330031)

采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接首次获得了池蝶蚌()线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为15939 bp, 由13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个SrRNA基因和28个长度为1—393 bp的非编码区组成; 除3-5、4、6、8、1-3、tRNA-D、tRNA-H之外, 其他大多数基因在L链编码。池蝶蚌线粒体全基因组序列、蛋白编码基因、tRNA基因、rRNA基因及非编码区的A+T含量分别为60.36%、59.84%、61.7%、60.23%及62.5%, 与其他淡水蚌类一致, 均表现出A+T偏好性, 淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现在非编码区长度的差异。池蝶蚌mtDNA的2-12SrRNA区域基因排列存在差异, 是3、tRNAHis、tRNAAla、tRNASer1、tRNASer2、tRNAGlu、2、tRNAMet8个基因发生重组造成。22个tRNA基因都具有典型的三叶草二级结构, tRNA-E与tRNA-W间的非编码区含有一个ORF区, 而控制区并未发现。从GenBank上下载的14种双壳纲贝类的mtDNA序列构建的系统进化树, 显示池蝶蚌与三角帆蚌亲缘关系最近。研究结果为淡水珍珠蚌线粒体基因重排及进化特征提供理论依据。

池蝶蚌; 线粒体基因组; 序列分析; 基因重排

动物的线粒体基因是典型的母性遗传, 是研究分子系统学的最佳靶序列。线粒体基因组全序列不但能对线粒体基因组结构及其物种的分子系统关系, 而且能对线粒体基因的种类和数量、基因重叠及重排现象、遗传密码子进化、同义密码子使用、RNA转录成熟机制及碱基组成的偏向性等问题进行研究。

近年来, 越来越多的学者[1—4]开展线粒体基因组全序列的研究。郑润玲等[1]对三角帆蚌、蒋文枰等[2]对褶纹冠蚌、陈玲等[4]对具有双单亲遗传现象的背瘤丽蚌F型线粒体基因组全序列进行分析, 对双壳贝类mtDNA基因重排现象进行了初步分析, 我们前期已对池蝶蚌的同工酶[5]、基因组DNA的遗传多样性[6]等方面展开了研究, 仅对池蝶蚌线粒体1[7]、2基因[8]进行了测定与分析, 为了进一步了解池蝶蚌的分类及系统进化、基因重排与重叠现象、碱基组成偏向性等问题, 本研究对池蝶蚌线粒体基因组全序列进行克隆与分析, 同时与已报道的蚌(贝)类线粒体基因组进行比较分析, 为进一步认识双壳贝类线粒体基因组的进化特征提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集、性别鉴定及其总DNA的提取

池蝶蚌采自江西省国家级池蝶蚌良种场。选取性成熟且发育良好的池蝶蚌, 用针管沾取少量性腺组织在显微镜下进行雌雄鉴定。取新鲜卵巢组织50—100 mg, 参照酚氯仿抽提方法[9]提取总DNA, 并保存于–80℃备用。

1.2 线粒体全序列的PCR扩增及测序

在NCBI中查找双壳贝类线粒体全序列, 通过Clustal W软件比对三角帆蚌([FJ529186])、褶纹冠蚌([FJ986302])及其他蚌科的核苷酸序列。在相对保守的区域, 运用Oligo 6.0软件设计可以覆盖线粒体基因全序列的17对引物(表1), 确保相邻两引物之间的重叠区域在100 bp以上。PCR反应体系为50 μL, 含模板mtDNA为100 ng, 10×PCR 缓冲液5 μL, 引物各1 μL (浓度10 μLmol/L), dNTP Mix (10 mol/L) 1 μL, r聚合酶2U, 灭菌水补足至50 μL。反应条件为95℃预变性5min, 94℃变性30s, 50—60℃退火30s, 72℃延伸1min, 35个循环, 最后72℃延伸10min。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 确认获得条带大小在800—1600 bp之间的目的片段, 采用胶回收试剂盒纯化目的片段, 转入大肠杆菌() DH5α感受态细胞, 筛选克隆送上海生工生物技术服务有限公司测序。

表1 池蝶蚌线粒体基因全序列扩增所用的引物

1.3 全序列的拼接、分析及提交

测序结果通过BLAST检索[10], 确定序列与Genbank中所收录的双壳贝类相应区段有较高同源性后, 用Clustal X软件[11]对所得序列进行编辑和排序比对, 并用SEAVIEW人工手动排检, 最后使用DNASTAR对所得的所有序列进行拼接, 得到基因组全序列。线粒体基因的结构图使用DNAMAN绘制。Editseq7.1统计序列总长、碱基组成和AT含量及氨基酸密码子的偏好性, tRNAscan-SE 1.21预测tRNA二级结构, 加上人工辅助校正[12, 13], RNA structure 5.1预测茎环结构[14], 全基因组序列经Sequin 7.9注释后提交GenBank (Accession No. HQ641406)。

1.4 系统进化树的构建

从GenBank下载了14种双壳贝类的mtDNA基因组全序列, 利用MEGA5.1软件, 以软体动物门多板纲(Polyplacophora)的半隐石鳖(NC_001636)作为外群, 基于mtDNA利用MP法构建系统进化树, 分析双壳贝类的系统进化关系。

2 结果

2.1 池蝶蚌mtDNA的结构特征

池蝶蚌mtDNA序列全长15939 bp, 包括13个蛋白质基因、22个tRNA、2个rRNA基因和28个长度为1—393 bp不等的非编码区, 除3-5、4、6、完整的8、1-3及tRNA-D、tRNA-H在H链编码外, 其他基因均在L链上编码(图1)。13个蛋白质基因只有4与4间存在8 bp重叠, 在2与tRNAMet之间、tRNALys与tRNAThr之间存在1 bp的重叠, tRNATyr与16S rRNA之间、16S rRNA与tRNALeu(UAG)之间、tRNAPro与之间, 存在的碱基重叠序列分别为2、11、9 bp。

图 1 池蝶蚌线粒体基因组全序列组成图谱

3-5,4,1-3,8,6, tRNAAsp和tRNAHis在H链上编码, 单个字母表示tRNA基因

蛋白编码基因共编码3690个氨基酸, 碱性氨基酸(K、R)146个, 酸性氨基酸(D、E)153个, 非极性氨基酸(A、I、L、F、W、V)1816个, 极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)879个, 非极性氨基酸占主导地位, 蛋白质主要为疏水蛋白质。此外, 13种蛋白质的氨基酸利用率最高的氨基酸及使用率最低的氨基酸分别为L、V、S、G和K、N、R, 疏水性氨基酸明显高于亲水性氨基酸(表2)。

在蛋白编码基因中,1、4、6和Cyt以I(AUU、AUC)作为起始密码子,5以V(GUG)作为起始密码子,6、8、2、3、2、3、4以M (AUA、AUG)作为起始密码子,1以L (UUG)为起始密码子。未见以M (AUA)作为起始密码子, 蛋白编码基因都具有完整的终止密码子(TAA或TAG), 没有出现以单个T终止的基因(表3)。

池蝶蚌线粒体含有28个非编码区, 总长为1329 bp, 占全序列的8.34%, 片段长度从1—393 bp不等。各碱基中T含量为24.5%、C含量29.7%、A含量为38.0%、G含量为7.8%, A+T为62.5%(表4)。其中大于100 bp的非编码区有5个, 最大的为393 bp, 位于tRNAGlu与tRNATrp之间, 其次为199 bp, 位于tRNAGln与5之间, 第三为151 bp, 位于tRNAGln与tRNAHis。

池蝶蚌线粒体基因组表现出A+T偏好性。线粒体全基因组A+T (60.36%)>C+G (39.64%), 蛋白编码基因A+T的含量为59.84%, 2个rRNA基因碱基总长为2130 bp, A+T为60.23%; 22个tRNA基因碱基总长为1405 bp, A+T的含量为61.7%(表5)。13个蛋白质基因碱基组成T的含量最高, 除5外, C碱基的含量最低。均表现出A+T百分比组成高于G+C含量, 在G、C含量中又表现出G含量高于C含量的现象(表4)。

表2 蛋白编码基因的氨基酸使用情况

表3 池蝶蚌蛋白编码基因的密码子偏好性

表4 池蝶蚌蛋白编码基因碱基组成

2.2 RNA基因的结构特征

池蝶蚌线粒体rRNA为两个亚基: 12S rRNA 和16S rRNA, 位于tRNAArg和tRNALys之间, 长度为835 bp, 亚基中间没有间隔区。16S rRNA位于tRNATyr和tRNALeu之间, 长度为1295 bp。12S rRNA的3′端存在一个12 bp的茎结构和一个4 bp的环结构, 茎和环的碱基组成表现出偏好性, 环上富含A而茎上富含G, C-T转换也是一种常见的形式。16S rRNA的3′端含有一个多聚腺苷酸位点。

池蝶蚌mtDNA具有22个tRNA基因, 长度在61—70 bp之间, 有2个tRNASer和2个tRNALeu, 两个tRNALeu的反密码子为TAA和TAG, 两个tRNASer的反密码子为TCG和TGA。除tRNAHis和tRNAAsp在H链外, 其余20个tRNA均分布于L链。22个tRNA基因的总长度为1405 bp。

氨基酸接受臂上, tRNAPhe和tRNAGlu为6 nt和一对不配对的U-C, tRNAAsn和tRNAGlu为6 nt和一对不配对的A-A, tRNAGly和tRNASer出现1 nt碱基的缺失, tRNALys出现一个碱基的插入, 其余15个tRNA为严格配对的7 nt。在反密码环上, 除tRNASer(UGA)外, 其余均为7个碱基。反密码茎上, tRNATrp为4 nt和一对不配对的U-U, 其余均为4 nt或5 nt。TΨC茎和TΨC环上, 碱基组成变化比较大。TΨC茎上, 22个tRNA有从1 nt到5 nt, 而tRNAGly和tRNAPro则缺失了TΨC环, 其中tRNASer(UGA)的TΨC茎和TΨC环长度皆最大, 它含有5 nt的TΨC茎, 7 bp的TΨC环。在D茎上, 最短的为tRNASer(UGU)为1 nt, 最长的有4 nt。D环上, 最长为tRNASer(UGU), 最短为tRNASer(UGA)。

2.3 池蝶蚌mtDNA系统进化分析

用BLAST基因分析软件比较池蝶蚌mtDNA与GenBank上珠蚌科物种, 发现与三角帆蚌同源性最高为91%, 与褶纹冠蚌为77%, 与射线佩饰真珠蚌为78%—83%, 与其他物种相似度较低。

为进一步研究池蝶蚌的遗传背景和分类地位, 将池蝶蚌线粒体基因组全序列与其他14种双壳贝类线粒体基因组全序列进行多重序列比对后, 以软体动物门多板纲(Polyplacophora)的半隐石鳖()作为外群, 利用MEGA5.1软件, 使用MP法构建系统进化树, 分析双壳贝类系统进化关系。从图2可以看出, 系统进化树由两大支构成, 一支由珠蚌科的8个种组成, 另一支由牡蛎目、贻贝目、帘蛤目及扇贝科的7个种组成, 这两支再汇合成一大支。其中在珠蚌科一支中, 池蝶蚌与三角帆蚌聚为一小支, 说明其与三角帆蚌亲缘关系最近。与林巧惠等[7]用2及王军花[8]等用1基因建树得出的结果一致。

表5 八种淡水蚌类线粒体全基因组碱基组成

、、、、、、数据引自文献[7]的数据

图 2 基于线粒体基因组全序列构建的MP树

3 讨论

3.1 池蝶蚌线粒体基因组结构特征分析

池蝶蚌线粒体基因组全序列除28个1—393 bp不等的非编码区外, 绝大部分序列为编码区(约占全长的92%), 37个基因除35、、13、6、8、tRNA-Asp、tRNA-His在H链编码外, 其他基因在L链上编码, 并按顺时针方向转录, 这与宋文涛等[15]报道的所有淡水双壳贝类在两条链上都有编码是一致的, 而与海水双壳贝类mtDNA的编码基因只在一条链上编码不同。

mtDNA的长度差异主要表现为非编码区。池蝶蚌mtDNA全长分别比三角帆蚌、射线佩饰真珠蚌短15、121 bp, 比褶纹冠蚌长227 bp, 而非编码区总长则分别比三角帆蚌短14 bp, 比射线佩饰真珠蚌、褶纹冠蚌分别长74、296 bp。其原因可能是由于非编码区所受的进化压力较小, 自然选择的约束力较弱, 与编码区相比具有更高水平的长度和位点多态性[2]。

淡水贝类线粒体非编码区含有两种类型的序列[15], 一类含有ORF区, 另一类为控制区。池蝶蚌最大非编码区位于tRNA-E与tRNA-W之间, 存在一个与斑马鱼跨膜4号结构域A亚基存在33%相似的ORF区域[16]。Wolstenholme,.[17]推测后生动物线粒体的控制区含有反向重复序列, 并且这种重复序列可能为双向启动子。分析所有大于100 bp区域, 均存在大于5 bp的重复单元, 如tRNA-Gln与5之间存在20个大于5 bp的重复单元, 均未发现反向重复序列。与射线佩饰真珠蚌[12]相同, 池蝶蚌mtDNA未发现控制区, 研究表明, 除海湾扇贝、紫贻贝和香港巨牡蛎有完整的控制区外, 其余双壳类物种的控制区都没有准确的定位。这些物种线粒体控制区难以确定, 是因为线粒体的非编码区以A和T两种碱基为主、长度变化大, 并缺少像脊椎动物的保守区域[18]。

编码区一个引人注目的基因是8基因, 它是ATP合酶的一个亚基, 可通过该酶合成ATP, 从而为细胞质的主动运输提供能量。三角帆蚌、褶纹冠蚌、射线佩饰真珠蚌等[1, 2, 16]大部分淡水贝类中具有完整的8基因, 而海水双壳贝类[2]除分叶管角贝、北极潜泥蛤和菲律宾蛤仔外均缺失8基因, 一些现象表明水体中各种盐离子的浓度与双壳贝类基因缺失有一定关联。淡水中的各种盐离子的浓度远远低于海水, 淡水双壳贝类需要更多的ATP来供能, 通过主动运输保持细胞质的渗透压平衡, 而海洋贝类大多生活在海洋浅水岩石或沙质水体底部, 水温较低, 能量代谢水平较低, 从而导致8基因编码功能的退化及基因片段的缺失[15]。池蝶蚌具有完整的8基因, 与其生活的水温较高, 需要的能量代谢水平较高, 因而需要更多的ATP来维持渗透压平衡。

池蝶蚌线粒体的12S rRNA和16S rRNA均为单拷贝且基因内部无间隔区, 这符合后生动物的典型性特征[20]。2个rRNA基因与三角帆蚌相似率最高, 达94%—95%, 提示池蝶蚌与三角帆蚌之间的亲缘关系最近。12S rRNA的3′端存在12 bp的茎和4 bp的环的二级结构, 且环上的核苷酸碱基替代率高于茎上的替代率, C-T转换也是一种常见的形式。茎和环的碱基组成也表现出偏好性, 环上富含A而茎上富含G。原因是环上的rRNA是与蛋白质结合的部分, 与蛋白质发生疏水相互作用, 而A是四种碱基中极性最小的, 因此多位于与蛋白质结合的部位。G=C碱基对间的氢键强于A=U、G=U, 位于茎上有利于维持rRNA的二级结构[20, 21]。

池蝶蚌线粒体的22个tRNA均能形成三叶草形二级结构, 3′端不含CCA, 而由转录加工到tRNA的3′端, 符合动物线粒体DNA的特征[15]。其中, tRNA-Gly和tRNA-Ser的氨基酸接受臂出现1 nt碱基的缺失, 这个现象也出现在褶纹冠蚌tRNA-Tyr[2]。池蝶蚌tRNA-Gly和tRNA-Phe均缺失TΨC环, 射线佩饰真珠蚌的tRNA-Cys[19]也出现了这种缺失, 而腹足动物线粒体tRNA的TΨC环长度变异较大[21](主要是环的缺失或减少)。茎上碱基的错配出现在几个分类群, 如池蝶蚌tRNA-Tyr的A-A及紫贻贝.[18]和腹足动物[21]T-G。这些变化是由于tRNA不同区域保守性不同所致, 其中, 最保守的为反密码子环, 最不保守的区域为二氢尿嘧啶环、TΨC环和TΨC茎。

3.2 线粒体基因排列与基因重叠现象

去除tRNA和8后, 池蝶蚌与其他淡水贝类蛋白质编码基因的排列顺序基本一致, 只在2和3位置发生变化。与陈玲等[4]报道的7种淡水蚌mtDNA2-12S rRNA基因排列顺序进行比较后发现, 池蝶蚌与背瘤丽蚌和三角帆蚌基因排列方式一致, 与褶纹冠蚌等其他蚌的基因排列存在差异, 在3、tRNAHis、tRNAAla、tRNASer1、tRNAser2、tRNAGlu、2、tRNAMet8个基因间发生了重排。这表明, 一方面淡水双壳贝类生活环境对线粒体基因组的进化影响较小, 另一方面也存在明显的基因复制和缺失机制。

淡水蚌类线粒体基因间都存在不同程度的基因重叠现象。Boyce,.[22]认为基因间的碱基重叠促进线粒体基因组小型化, 而小型线粒体基因组复制所需时间短, 具有一定的自然选择优势。池蝶蚌蛋白编码基因的4与4间存在8 bp重叠, 与褶纹冠蚌[2]、贻贝[18]等淡水双壳贝类4和4之间存在核苷酸重叠现象相似, 与海水双壳贝类4和4之间不存在核苷酸重叠现象不同。基因重叠的原因可能是由于不完整终止密码子的出现, 表现为一个单独的T-或者TA-, 在翻译加工后, 通过多聚腺苷酸化成为完整的终止密码子[2]。

3.3 密码子与氨基酸使用偏好性

线粒体全基因组中A+T含量(64.27%) >褶纹冠蚌(63.76%)>(62.62%)>射线佩饰真珠蚌(62.35%)>池蝶蚌(60.36%)>背瘤丽蚌(60.28%)>三角帆蚌(60.24%)(表 5), A+T含量与无脊椎动物线粒体A或T的密码子偏好性一致[20]。原因可能是线粒体是细胞进行氧化磷酸化和形成ATP的主要场所, 因此线粒体中需含有大量的ATP, 从碱基角度讲就偏好于A、T。

池蝶蚌蛋白编码基因出现氨基酸使用的偏好性, 最常使用的都为非极性氨基酸Leu、Val和Phe, 与三角帆蚌[1]及射线佩饰真珠蚌[19]一致; 最不常用氨基酸为极性氨基酸Gln, 与三角帆蚌[1]、褶纹冠蚌[2]一致。密码子的第三位碱基为A、C的比例明显高于G、T, 第二位碱基为嘧啶的比例明显高于嘌呤, NYN类型的密码子多编码疏水性氨基酸。线粒体编码的这些蛋白质都是与其内膜相结合, 直接参与呼吸链电子传递、能量合成的功能组分, 疏水氨基酸的偏好性与其功能是相适应的。

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Complete sequence analysis of mitochondrial genome in

Sheng Jun-qing, Lin Qiao-hui, Wang Jun-hua, Peng Kou and Hong Yi-jiang

(School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

The complete mitochondrial genome ofwas obtained by using polymerase chain reaction (PCR), shot-gun sequencing. The genome contains 15939 base pairs and 13 protein-coding genes, 22 transfer RNA genes, 2 ribosomal RNA genes, and 28 non-coding regions ranged from 1bp to 393bp in size. Most genes were encoded on the L strand, while3-5,,6,8,1-3, tRNA-D, and tRNA-H were encoded on the H strand. The structure and organization of mitochondrial genomes ofand other 7 freshwater mussels were analyzed by using comparative genomics and bioinformatics methods. Results showed that: (i) Strong bias was toward A+T for the genome of. (ii) The striking mitochondrial genome difference in the size performed on the non-coding regions in all the freshwater mussels. (iii) The gene arrangement ofwas identical to that ofand, but was different from that of,,,andbetween COX2 and 12S rRNA. The difference was caused by rearrangement of 8 genes, including3, tRNAHis, tRNAAla, tRNASer1, tRNASer2, tRNAGlu, ND2 and tRNAMet. (iv) Protein-coding genes contained 4 initiation codons which were I (AUU, AUC), V (GUG), M (AUG), and L (UUG) and 13 genes have complete stop codons (UAA or UAG). (v) 22 tRNAs had typical cloverleaf structure. There were an ORF region between tRNA-E and tRNA-W but no control region. The MP-tree based on mtDNA genomes showed the evolutionary position ofrelative to that of 14 other bivalvia species. The result showed thatandhad the closest relationship than others. The results of this study provide the basis for gene rearrangement and evolutionary characterization of mitochondrial genome in bivalves.

; Mitochondrial genome; Sequence analysis; Gene rearrangement

2013-04-16;

2013-12-27

国家公益性行业科研专项(200903028); 国家自然科学基金(31160534); 江西省科技落地计划(12001); 江西省自然科学基金(20122BAB204016)资助

盛军庆(1978—), 女, 江西新余人; 博士; 主要研究方向为水产动物遗传育种学及免疫学。E-mail: shengqingjun@163.com

洪一江(1963—), 男, 福建南安人; 教授, 博士生导师; 主要研究方向为水产动物遗传育种学。E-mail: yjhong2008@163.com

Q781

A

1000-3207(2014)02-0320-08

10.7541/2014.46