3种芹菜茎组织总RNA提取方法的比较研究

董姻然　陈湘宁　常希光等

摘要 [目的]为了获得质量较好的芹菜茎的总RNA，为后续分子生物学试验提供基础。[方法]试验对1种RNA提取方法（Trizol法）和2种RNA提取试剂盒（RNA prep Pure Plant Kit法、RNA simple Total RNA Kit法）方法进行比较研究。[结果]RNA prepPure Plant Kit方法得率低，且OD260/OD280值低于1.8，Trizol法OD260/OD230高于2.0，且得率低于RNA simple Total RNA kit法。只有RNA simple Total RNA kit法提取的RNA质量最好，得率最高。[结论]与Trizol法和RNA prep Pure Plant Kit法相比，RNA simple Total RNA Kit法提取的芹菜茎总RNA得率高，完整性好，凝胶电泳泳道无杂质，可以满足半定量RTPCR的试验需要。

关键词 芹菜；总RNA提取；RNA simple Total RNA Kit法

中图分类号 S636.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02273-03

The Comparison of Several Kinds of Methods for Extracting Total RNA from the Stalk of Celery

DONG Yinran， CHEN Xiangning et al

（Department of Food Science and Engineering， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206； Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue， Beijing 102206）

Abstract [Objective] In order to obtain better quality total RNA in the stalk of celery and lay the foundation for subsequent molecular biology experiments. [Method] One RNA extraction method（Trizol method） and two RNA extraction kits （RNA prep Pure Plant Kit method， RNA simple Total RNA Kit method） were compared. [Result] The yield of RNA prepPure Plant Kit is low， OD260/OD280 value is lower than 1.8， OD260/OD230 of Trizol method is higher than 2.0， the yield is lower than RNA simple Total RNA kit method. RNA extracted by RNA simple Total RNA kit has the best quality and the highest yield. [Conclusion] The results showed that the Trizol method was better than two RNA extraction kit method， the total RNA isolated with Trizol method had high integrity， high yield， good stability， and no pollution in the gel electrophoresis track. And then could meet the needs of the semiquantitative RTPCR test.

Key words Celery； Total RNA extraction； RNA simple Total RNA Kit method

芹菜在我國广泛种植，具有清热解毒、宣肺利尿、降低血压和血脂等多种食疗功效[1]，是一种低热量蔬菜，每100 g只有83.68 kJ热量，却含有丰富的维生素C（32.0 mg）、维生素A （0.207 mg）、钾（280.00 mg）等营养物质[2]，深受人们的喜爱。但是芹菜在采后贮藏运输过程中极易出现失水、黄化、萎蔫、质地变劣和腐烂等现象，造成芹菜大量浪费。随着生活水平的提高，人们对这种健康绿色蔬菜的需求量也越来越大，因此开展关于延长芹菜储藏期的研究已具有重大意义。

目前，学者们对其他水果蔬菜从分子生物学角度研究其采后保鲜机制为芹菜的保鲜研究奠定了基础。赵宏亮研究香蕉采后生理变化和分子水平上的变化结合起来，从分子水平上研究香蕉采后相关基因的表达变化[3]。罗志娇从分子生物学角度克隆双孢菇采后褐变相关基因，为实现蘑菇抗褐变定向育种的奠定了基础，延长了双孢菇采后的储藏期[4]。进行分子生物学试验的第一个关键步骤是提取出质量好的总RNA[5-6]，但目前国内外对芹菜茎总RNA提取的研究鲜有报道。因此，笔者比较几种芹菜茎中总RNA的提取方法，旨在获得一种适合芹菜茎组织总RNA提取的快速、高效的方法，为在从分子水平上对芹菜进行研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。芹菜，采于金六环蔬菜产业基地，由实验室-80 ℃保存。

1.1.2

主要仪器。AB104N电子天平，购自上海第二天平仪器厂；T100BIORAD pcr仪，购自郑州南北仪器有限公司；HHS114水浴锅，购自上海雷韵试验仪器有限公司。

1.1.3

主要试剂。引物合成及扩增产物测序，均由金维智生物科技有限公司完成；化学试剂、反转录酶和Tag酶，均购自天根生化科技有试验限公司；其他试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1

RNA提取的前处理。RNA提取过程中所用研钵、药匙、玻璃器皿于180 ℃干热处理至少4 h；塑料容器、耗材及配制药品的ddH2O均用终浓度为0.1%的DEPC处理过夜，并用烘箱烘干。

1.2.2

Trizol法。①取100 mg新鲜的芹菜茎组织于液氮预冷的研钵中，迅速研磨，直至芹菜茎组织彻底粉碎；②将磨碎的芹菜茎组织放入含1.0 ml Trizol裂解液的离心管中，涡旋15 s，在室温下放置5 min；③在上述离心管中，加入氯仿（每1.0 ml Trizol加0.2 ml氯仿），涡旋15 s，在室温下放置2～3 min后，于12 000 r/min、4 ℃离心15 min；④吸取上层水相置于新离心管中，加入异丙醇（每1.0 ml Trizol加0.5 ml异丙醇），在室温下放置10 min后，于12 000 r/min、4 ℃离心10 min；⑤弃上清，按照每1.0 ml Trizol加1.0 ml浓度75%乙醇进行洗涤，轻轻摇晃洗涤，于12 000 r/min、4 ℃离心5 min；⑥弃上清，让沉淀的RNA在室温在自然干燥，用30 μl RNasefree water溶解RNA沉淀。

1.2.3

RNA prep Pure Plant Kit法。天根生化科技有限公司RNA prep Pure Plant Kit提取方法参考说明书。①取50～100 mg植芹菜茎在液氮中迅速研磨成粉末，加入500 μl已加入β巯基乙醇的SL，立即涡旋剧烈振荡混匀，于12 000 r/min离心2 min；②将上清液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），于12 000 r/min离心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNaseFree的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；③缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，于12 000 r/min离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；④向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，于12 000 r/min离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；⑤DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I储存液放入新的RNaseFree离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀；⑥向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室温放置15 min。⑦向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，于12 000 r/min离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；⑧向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），于12 000 r/min离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复一次；⑨于12 000 r/min离心2 min，将吸附柱CR3放入一个新的RNaseFree离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30 μl RNaseFree ddH2O，室温放置2 min，再于12 000 r/min离心1 min，得到RNA溶液。

1.2.4

RNA simple Total RNA Kit法。天根生化科技有限公司RNA simple Total RNA Kit提取方法参考说明书：①②③同Trizol法；④把水相转移到新管中，缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，于4 ℃、12 000 r/min离心30 s，弃掉收集管中的废液；⑤向吸附柱CR3中加入500 μl已加入乙醇的去蛋白液RD，于4 ℃、12 000 r/min，离心30 s，弃废液，将CR3放入收集管中；⑥向吸附柱CR3中加入700 μl已加入乙醇的漂洗液RW，室温静置2 min，于4 ℃、12 000 r/min，离心30 s，弃废液，离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻以充分晾干；⑦将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加30 μl RNasefree water 溶解RNA沉淀。

1.2.5

總RNA完整性检测。分别取3种方法提取总RNA，在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测，紫外光下观察并拍照。

1.2.6

总RNA纯度及浓度测定。分别取3种不同方法提取的总RNA各1.0 μl，用超微量分光光度计（Thermo NanoDrop 2000）测量OD260/OD280、OD260/OD230以及RNA的浓度，每个样测量3次，取平均值。

1.2.7

RTPCR检测。①cDNA第1链的合成。分别取3种方法提取的总RNA，根据表l依次加入不同组分，于42 ℃孵育30 min，于85 ℃加热5 min。②RTPCR。根据已在GENEBANK中登陆的芹菜PAL基因序列（登录号：L38898）设计特异引物PALF：5′GAAGCCTGAATTTACCGA3′，PALR：5′AGCACCCTTGAATC CATA3′；根据已在GENEBANK中登陆的芹菜4CL基因序列（登录号：X13325）设计引物4CLF：5′TCGGTGAGGACGGTTAT3′，4CLR：5′TCGGAAATGGTAGGATGA3′，芹菜内参βactin特异引物参考已发表文章[7]，βactinF：5′CTTCCTGCCATATATGATTGG3′，βactinR：5′GCCAGCACCTCGATCTTCATG3′。PCR体系见表2，反应程序为：95 ℃，3 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共25个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.8

凝胶回收测序。PCR产物回收按照天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP209）说明书进行，回收产物交由金维智生物科技有限公司测序。使用DNAMAN软件，对胶回收产物测序结果和已经登录在GENBANK的PAL、4CL序列与进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取RNA结果分析

2.1.1

RNA纯度及浓度测定。已知OD260/OD280、OD260/OD230的比值在1.8～2.0为质量好的RNA[8]，可以用作后续试验。由表3可知，RNA prepPure Plant Kit方法得率低，且OD260/OD280值低于1.8，Trizol法OD260/OD230高于2.0，且得率低于RNA simple Total RNA kit法。只有RNA simple Total RNA kit法提取的RNA质量最好，得率最高，满足条件。

2.1.2

RNA样品凝胶电泳分析。凝胶电泳分析是判断所提取RNA质量的一种重要的手段。从电泳胶上18S和28SrRNA的完整性，可以判断RNA有无降解及降解程度，也可以判断得率情况。图1表明，Trizol法和RNA prepPure Plant Kit法提取条带较暗，说明提取的RNA浓度低，且Trizol法提取的在进样孔里有一条模糊的条带，说明有蛋白质污染。只有RNA simple Total RNA Kit法提取RNA28S亮度是18s的2倍，条带完整，带与带之间没有明显的弥散，点样孔内无亮斑，整个条带无拖尾现象，说明RNA相对比较纯净，无蛋白质污染，质量最好。综上所述，采用RNA simple Total RNA Kit法提取芹菜茎总RNA，效果最理想。

注：1为Trizol法；2为RNA prepPure Plant Kit法；3为RNA simple Total RNA Kit法。

图1 不同方法提取芹菜总RNA电泳结果

2.1.3

半定量RTPCR检测结果。图2表明，以cDNA为

模板扩增PAL、4CL、ACTIN经凝胶电泳检测后，可清晰的看

到3条亮带，目的序列的大小分别为为487、491和250 bp，与得到的PCR产物大小一致，并且条带清晰，整齐。使用DNAMAN软件对PAL、4CL进行同源性比对可知，试验扩增得到的PAL、4CL序列与已经在GENBANK登录的PAL、4CL序列的同源性分别达到96.38%、93.42%，说明试验反转录的cDNA质量较好，具有可重复操作性，更进一步说明了按RNA simple Total RNA Kit方法提取芹菜茎属总RNA质量高，能满足后续的分子生物学试验的要求（图3～4）。

3 讨论

不同的RNA提取方法各有其优缺点，应对不同的植物组织选择不同的RNA提取方法，以满足后续分子生物学试验的要求。Trizol法在提取植物总RNA方面应用比较广泛，但该方法提取繁琐，耗时长，吸取上清液时极容易有蛋白质的污染；同时，提取的RNA很容易混有芹菜茎固有色素，影响最终RNA浓度的检测，对后续分子生物学试验有很大的影响。RNA prepPure Plant Kit法主要针对含多糖多酚的植物组织的提取，成本高，操作复杂，RNA得率低。RNA simple Total RNA Kit法操作簡单，成本低，是在Trizol法的基础上经过改进开发的新一代产品，提高了裂解液的裂解能力和提取的灵敏度，同时对硅基质膜的改进增强了对RNA的吸附能力，并添加蛋白洗脱液，2 h左右即可提取到芹菜茎的总RNA，既保证了无蛋白质和色素杂质的污染，又防止因操作复杂导致的RNA降解，得到的RNA质量很好，这可能就是