血管紧张素II有效抑制大鼠高血压模型血管过氧化氢酶表达的实验研究

沈 凯 袁国裕 陈士良

血管紧张素II有效抑制大鼠高血压模型血管过氧化氢酶表达的实验研究

沈 凯 袁国裕 陈士良

目的探讨血管紧张素II（AngII）对大鼠血管过氧化氢酶（CAT）表达的影响。方法利用AngII微泵灌注制备高血压大鼠模型，分为AngII组、生理盐水组、对照组，每组6只。分别检测0、3、7、14d后各组大鼠尾动脉收缩压；连续灌注14d后，取材观察各组大鼠血管形态学改变；并采用免疫组化法检测各组大鼠颈动脉血管中CAT及氧化应激产物4-羟烯酸（4HNE）蛋白的表达情况。结果与生理盐水组及对照组相比，AngII灌注后能够显著提高大鼠尾动脉收缩压水平及颈动脉血管中膜厚度（均P＜0.01）；免疫组化显示AngII组颈动脉血管CAT表达显著降低，而4HNE表达显著增加（均P＜0.01）。结论Ang II可下调大鼠血管中CAT表达而导致氧化应激的发生。

高血压；血管紧张素II；过氧化氢酶

高血压病近年来已成为危害人类健康的主要疾病之一。血管重塑是高血压病的一种显著病理特征，也是导致高血压机体并发症如动脉粥样硬化、脑卒中及心、肾功能衰竭的主要原因之一[1-2]。病理状态下血管外膜可产生大量活性氧（ROS），通过自分泌、旁分泌作用参与血管重塑的发生。过氧化氢酶（CAT）是一种重要的抗氧化酶，其在清除ROS特别是H2O2时发挥着重要的作用，可以保护机体避免氧化应激造成的损伤[3-4]。本文通过建立血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠高血压模型，探讨AngⅡ对血管外膜中CAT表达的作用，以期为高血压血管重塑的防治提供新的线索。

1 对象和方法

1.1 对象和材料清洁级雄性SD大鼠（体重150～200g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供），AngⅡ（美国Sigma公司），Alzet渗透微泵（型号2002），Softron BP98A尾动脉血压测量仪，山羊血清封闭液、免疫组织化学用载玻片（武汉博士德公司），DAB显色试剂盒（福建迈新公司），4-羟烯酸（4HNE）一抗（美国Abcam公司），CAT一抗（美国Sigma公司），HRP标记的二抗（美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及大鼠高血压模型的建立雄性SD大鼠18只，运用SPSS10.0软件编程随机分为3组，每组6只，即AngⅡ组[500ng/（kg·min）]、生理盐水组（10μl/h）和对照组。各组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，背部皮肤除毛，75%酒精棉球消毒，剪开皮肤。钝性分离皮下组织，埋入预置AngⅡ或生理盐水的微量泵，逐次缝合皮下及皮肤。连续灌注14d，分别在0、3、7、14d利用Softron BP98A尾动脉血压测量仪测定未经麻醉的、安静状态下的大鼠血压。每次测量至少3次，取平均值。

1.2.2 大鼠颈动脉形态学检测14d后，用10%水合氯醛腹腔麻醉各组大鼠，分离并剪下颈动脉，4%多聚甲醛4℃灌注固定过夜、石蜡包埋后行病理切片，HE染色，光镜下检测血管中膜厚度。

1.2.3 大鼠颈动脉CAT、4HNE免疫组化染色石腊组织切片经干燥箱烤片2h后,常规予二甲苯、高浓度至低浓度乙醇脱腊至水，3%的H2O2封闭20min，以0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以0.1M枸橼酸盐缓冲液热抗原休复，0.01MPBS洗涤，山羊血清封闭20min。甩去封闭液，滴加一抗（CAT 1：100），4℃静置过夜，切片自然复温，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗切片3次，每次5min，滴加二抗（eGFP 1：200），室温静置60min，PBST洗3次，每次5min，滴加DAB显色液显色，显微镜下观察显色，及时水洗终止显色，苏木素复染细胞核，1%盐酸酒精分化，自来水漂洗30min返蓝，75%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。每次设阴性对照，即以IgG代替一抗，其余步骤相同。4HNE免疫组化染色方法同CAT，一抗稀释比例（4HNE1：100），二抗稀释比例（PCNA 1：200）。

1.3 统计学处理采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠的尾动脉收缩压变化情况见表1。

表1 各组大鼠的尾动脉收缩压变化情况（mmHg）

由表1可见，在灌注前（0d），各实验组大鼠的尾动脉收缩压差异无统计学意义（P＞0.05）。在第3、7、14天AngⅡ组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.2 各组大鼠颈动脉厚度及形态学大鼠颈动脉中膜厚度为AngⅡ组（60.16±10.36）μm，生理盐水组（41.16±6.73）μm，对照组（39.83±9.98）μm，与对照组及生理盐水组相比，AngⅡ组颈动脉中膜增厚，差异均有显著统计学意义（均P＜0.01），见插页图1。

2.3 各组大鼠颈动脉CAT、4HNE表达情况大鼠颈动脉CAT的表达为AngⅡ组0.16±0.03，生理盐水组0.28±0.07，对照组0.26±0.05，4HNE的表达为AngⅡ组0.22±0.05，生理盐水组0.15±0.03，对照组0.13±0.02，AngⅡ组CAT的表达较对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），而4HNE的表达较对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见插页图2、3。

3 讨论

近年来，高血压病的患病率呈逐年增高的趋势，是危害人类健康的主要疾病之一。血管重塑伴随高血压血管疾病的始终，与高血压形成互为因果。血管重塑是血管壁为适应血管腔内血流动力学环境变化而产生的病理生理现象,包括适应性血管重塑和病理性血管重塑[5]。在病理状态下血管外膜可产生大量活性氧，通过自分泌、旁分泌作用参与血管重塑的发生[6]。

CAT是一种重要的抗氧化酶，其在清除ROS特别是H2O2时发挥着重要的作用，可以保护机体避免氧化应激造成的损伤。正常情况下，血管壁产生的ROS处于动态平衡，如果其大量产生或者清除受到抑制，可导致ROS大量蓄积，引起血管重塑的发生[7]。在病理状态下，CAT表达及活性受到抑制时，机体的氧化-抗氧化系统的平衡就会遭到破坏，此时大量ROS蓄积就会导致病理性血管重塑的发生。因此，阻断、控制ROS生成，或增加抗氧化物酶的表达和活性对控制血管重塑的发展具有重要的临床意义[8]。

我们在前期的体外研究中已经证实AngⅡ可下调血管外膜成纤维细胞内CAT表达和活性，导致H2O2大量蓄积、细胞发生表型转化，提示病理情况下血管外膜CAT缺陷可能是血管重塑发生的重要机制。抗氧化物酶CAT及其相关因素在血管外膜重塑的发生、发展过程中可能起重要作用[9-10]。因此在本研究中我们着眼于抗氧化系统在AngⅡ诱导的高血压血管重塑中的作用，本研究证实了在AngⅡ诱导的高血压模型中，血管中抗氧化酶CAT表达显著降低。这提示恢复抗氧化系统的表达能够显著改善AngⅡ诱导的高血压血管重塑。

综上所述，我们的研究证实CAT参与了AngⅡ诱导的血管重塑过程，AngⅡ导致的氧化/抗氧化体系的失衡是导致血管重塑的重要原因，为高血压及其并发症的防治提供了新的理论思路和潜在的治疗靶点。

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The effects of AngiotentionⅡon Catalase expression of rat vessels

SHEN Kai,YUAN Guoyu,CHEN Shiliang.Department of Cardiology,Zhoushan People′s Hospital,Zhoushan316000,China

SHEN Kai,E-mail:sk-555@163.com

Objective To investigate the effects of Angiotensin(Ang)Ⅱon the expression of catalase of rat vessels. Methods18 rats were randomly divided into Ang II group(n=6)infused with Ang II by micro-pump and saline group (n=6)infused with saline for 14 days,and control group(n=6).Systolic pressure of tail artery was measured at 0,3,7 and 14 day.The rats were sacrificed for observing vessel morphological changes at 14th day.Catalase and oxidative stress product-4HNE were determined by immunohistochemistry.Results Systolic blood pressure of tail artery as well as the thickness of carotid artery media increased significantly,Catalase was significantly lower while oxidative stress product-4HNE was higher in Ang II group compared to control group(all P＜0.01).Conclusion Ang Ⅱ may promote oxidative stress through inhibiting catalase expression of rat vessels.

Hypertension;AngiotentionⅡ;Catalase

2013-08-29）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省医药卫生科技计划（项目编号：2011KYA170）

316000浙江省舟山医院心内科

沈凯，E-mail:sk-555@163.com