术后肠梗阻对大鼠脑内nesfatin-1表达影响

（青岛大学医学院山东青岛266021；*青岛市立医院）

术后肠梗阻对大鼠脑内nesfatin-1表达影响

武庆杰，胡沙沙，逄明杰＊，祝海＊，王萍＊，郭菲菲，孙向荣，徐珞

（青岛大学医学院山东青岛266021；*青岛市立医院）

目的探讨术后肠梗阻对大鼠脑内nesfatin-1表达及临床意义。方法大鼠经腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150）mg/kg麻醉后行腹部手术，术后2小时后经心灌注固定，免疫组化观察大鼠脑内c-Fos和nesfatin-1免疫阳性神经元的表达。结果手术组大鼠下丘脑室上核（SON）(P＜0.01)，室旁核（PVN）（P＜0.01)，蓝斑（LC）(P＜0.05)、动眼神经副核（EW）(P＜0.01)、中缝苍白核（rRPa）(P＜0.05)、孤束核（NTS）(P＜0.01)、延髓腹外侧区（VLM）(P＜0.01)神经元c-Fos表达显著增加,而nesfatin-1免疫阳性神经元表达无显著改变(P＞0.05)。发现腹部手术可激活的c-Fos神经元中，在下丘脑SON内99%、apPVN内71%、lmPVN内47%、mmPVN内41%以及mp-PVN内9%表达nesfatin-1；在脑干、腹部手术可分别激活LC内91%、rRPa内82%、EW和VLM内74%、NTS 14%表达c-Fos的nesfatin-1神经元。结论腹部手术可激活下丘脑和脑干摄食相关中枢内nesfatin-1神经元，其对摄食和胃排空障碍疾病调控具有潜在临床意义。

腹部手术；Fos；下丘脑；NUCB2；术后肠梗阻；大鼠大脑；免疫组化；Nesfatin-1

动物腹部手术可造成术后肠梗阻模型，在胃肠道手术后，表现为有效抑制肠内容物转运，延迟胃排空。腹部手术中可激活实验动物和人类应激反应时的内分泌标记物[1-3]。其前研究报道过大鼠腹部手术后可激活大鼠大脑特定核团的神经元，包括下丘脑视上核（SON）、室旁核（PVN）及含儿茶酚胺的脑干区域如蓝斑（LC）、孤束核（NTS）、延髓腹外侧区（VLM）的神经元[4-5]。

Nesfatin-1是最近在下丘脑中发现的来源于前体蛋白NUCB2的含82个氨基酸的多肽，侧脑室注射或外周注射后可减少大鼠进食[6]。Nesfatin-1mRNA存在于大鼠多个核团[7-9]，包括下丘脑和脑干中表达丰富的自主核团[9]。最近发现给大鼠侧脑室注射Nesfatin-1不仅可减少进食，而且会延迟胃排空[10]。在实验动物和人类[11]腹部手术后可造成胃肠梗阻现象，推测术后胃肠梗阻可能激活nesfatin-1神经元。因此，目前的研究，我们观察大鼠腹部手术造成术后肠梗阻是否能激活大脑中nesfatin-1神经元。

1 材料与方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠，体重280～350 g，每笼4只，在特定温度、湿度、24 h昼夜循环光照条件下生活，自由进食和饮水。

1.2 方法

1.2.1 腹部手术16只大鼠分装在单独笼内，禁食20 h，自由饮水。在禁食后第10 h，经腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150mg/kg)麻醉大鼠，麻醉后四肢固定于手术台上，腹部备皮后碘伏消毒铺巾，于下腹部正中线做一个长约3 cm的切口，依次切开皮肤、腹壁肌肉后进腹。实验组大鼠（8只）术后将盲肠取出，用盐水湿纱布由盲肠末端自下而上擦拭肠管，反复6次左右，随后将盲肠放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。麻醉和手术持续大约10min，动物在2～3min后苏醒。对照组大鼠（n=8）仅接受麻醉不进行腹部手术。

1.2.2 c-Fos和Nesfatin-1免疫组化染色大鼠经腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150mg/kg)麻醉[35]，经心灌注固定，亦即用0.9%氯化钠溶液和4%多聚甲醛灌注固定。断头取脑，后固定12 h，10%蔗糖脱水24 h后速冻。冠状切片，用自动漂浮技术孵育脑片。加兔抗-c-Fos血清，4℃过夜，随后加入山羊抗兔IgG，孵育2 h。Fos显色用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）和硫酸镍铬。脑片继续在兔抗鼠nesfatin-1孵育液中孵育12 h（℃），用生物素-羊抗兔IgG孵育2 h，3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色。切片梯度乙醇和二甲苯脱水，封片。深蓝色核染的是c-Fos细胞，棕色细胞质显色的是Nesfatin-1免疫阳性细胞，胞质为棕色，核染色为黑色的是双染细胞。

1.2.3 细胞计数光学显微镜下观察c-Fos和nesfatin-1免疫阳性细胞。通过Paxinos和Watson’s图谱定位，定量评估免疫反应细胞数。c-Fos和nesfatin-1免疫阳性细胞数=c-Fos或nesfatin-1平均细胞数/每个核团的细胞总数。

1.3 统计学处理用GraphPad Prism 3.0软件分析，所有数据采用方差分析和t检验。

2 结果

2.1 术后肠梗阻对脑内nesfatin-1-免疫阳性细胞表达的影响本研究定量分析结果显示，对照组和手术组大鼠SON或PVN内nesfatin-1免疫阳性细胞数无明显差异(P＞0.05;图1和表1)。与对照组相比，手术处理组大鼠PVN内c-Fos免疫阳性神经元显著增加（表1），即：mpPVN(t=17.2;P＜0.01)、mmPVN(t= 25.8，P＜0.01)、lmPVN(t=19.5;P＜0.01)和apPVN(t= 22.1;P＜0.01)内c-Fos免疫阳性神经元表达显著增多。手术处理组大鼠下丘脑SON和PVN内c-Fos/ nesfatin-1双染细胞与对照组相比也显著增加（图1，表1），即：SON(t=6.9,P＜0.01)、apPVN(t=58.4,P＜0.01)、lmPVN(t=18.5,P＜0.01),mmPVN(t=16.5,P＜0.01)和mpPVN(t=6.9,P＜0.01)内c-Fos/nesfatin-1双染细胞显著增多，腹部手术分别可激活SON内99%、apPVN内71%、lmPVN内47%、mmPVN内41%以及mpPVN内9%的表达c-Fos的nesfatin-1神经元，与对照组相比，**P＜0.01，见图1。

图1 术后肠梗阻对视上核Nesfatin-1和c-Fos表达的影响

表1 腹部手术对大鼠下丘脑PVN nesfatin-1和c-Fos表达的影响（±s,number/section)

表1 腹部手术对大鼠下丘脑PVN nesfatin-1和c-Fos表达的影响（±s,number/section)

P均＜0.01

组别n apPVN mpPVN mmPVN lmPVN对照组8 38.5±12.2 48.2±15.1 99.5±32.1 160.2±52.1手术组8 41.2±13.1 48.2±15.1 98.2±31.1 149.3±45.1

表2 腹部手术对大鼠下丘脑PVN c-Fos表达的影响（±s,number/section)

表2 腹部手术对大鼠下丘脑PVN c-Fos表达的影响（±s,number/section)

P均＜0.01

组别n apPVN mpPVN mmPVN lmPVN对照组8 5.1±1.2 24.3±7.2 13.2±4.3 16.5±5.2手术组8 21.2±6.4 102.2±33.4 82.3±26.1 52.3±15.4

表3 腹部手术对大鼠下丘脑PVN c-Fos+Nesfatin-1表达的影响（±s,number/section)

表3 腹部手术对大鼠下丘脑PVN c-Fos+Nesfatin-1表达的影响（±s,number/section)

P均＜0.01

组别n apPVN mpPVN mmPVN lmPVN对照组8 2.1±0.9 3.1±1.2 2.2±0.8 2.3±0.9手术组8 17.2±5.1 23.3±6.1 30.2±9.1 18.3±5.6

注：apPVN：室旁核前侧小细胞区，mpPVN：室旁核内侧小细胞区，mmPVN：室旁核内侧大细胞区，lmPVN：室旁核侧面大细胞区。

2.2 术后肠梗阻对中脑和脑干nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达的影响腹部手术2 h后，上述脑核团内nesfatin-1免疫活性细胞表达无明显改变(P＞0.05)；但腹部手术可使LC(t=2.6,P＜0.05)、rRPa(t= 2.57,P＜0.05)、EW(t=10.74,P＜0.01)、VLM(t=7.86,P＜0.01)和NTS(t=10.46,P＜0.01)内c-Fos免疫反应神经元数量显著增加；结果显示，腹部手术分别可激活LC内91%、rRPa内82%、EW和VLM内74%、NTS 14%的表达c-Fos的nesfatin-1神经元，与对照组相比，*P＜0.05;**P＜0.01。见图2。

A（LC中nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达）、B（EW中nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达）、C（rRPa中nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达）、D（NTS中nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达）、E（VLM中nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达）、LC（蓝斑）、EW（动眼神经副核）、rRPa（中缝苍白核）、NTS（孤束核）、VLM（延髓腹外侧区）。

图2 术后肠梗阻对中脑和脑干nesfatin-1和c-Fos免疫阳性神经元表达的影响

3 讨论

有文献报道下丘脑SON和PVN均有nesfatin-1免疫阳性神经元表达。有文献报道，中脑和脑干内也有nesfatin-1的表达，如蓝斑（LC）、动眼神经副核（EW）、中缝苍白核（rRPa）、孤束核（NTS）以及延髓腹外侧区（VLM）均有nesfatin-1的表达[7,8,9]。本研究结果显示，大鼠腹部手术2 h后下丘脑、中脑及脑干诸核团均有不同程度的c-Fos表达增加。腹部手术还可激活绝大多数SON（99%）、LC（91%）、rRPa（82%）、EW和VLM（74%）、apPVN（71%）内的nesfatin-1免疫阳性神经元，NTS（14%）、mmPVN（41%）以及mpPVN（9%）内只有少量nesfatin-1神经元被激活。结果提示，腹部手术可激活脑核团内nesfatin-1免疫阳性神经元的表达。这与文献[7-9]报道的结果基本一致。

结果显示，在mpPVN中激活的c-Fos免疫阳性神经元是apPVN中的5倍，这可能是mpPVN的面积大于apPVN所致。然而，腹部手术可激活apPVN中大部分（71%）的nesfatin-1神经元，而mpPVN中仅激活9%的nesfatin-1神经元。这种差异可能与mpPVN神经元的多样化有关，有文献报道，mpPVN中除有促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)和nesfatin-1外，还包含应激条件下可激活的甲状腺激素释放激素、生长激素释放激素[12]。功能学研究表明，在PVN，尤其是在小细胞区包含CRF神经元的部位，对手术2 h后胃排空延迟的发生具有重要作用[2-5]。胃电刺激可改善患者肠梗阻症状[13]，与PVN中CRF神经元活性减弱相关[14]。侧脑室注射nesfatin-1，大鼠进食减少，该效应可能是通过CRF信号通路而实现的，即应用选择性CRF2受体拮抗剂astressin2-B，可完全阻断nesfatin-1抑制大鼠的摄食效应[15]。因此，室旁核小细胞区nesfatin-1神经元的激活可能参与术后胃排空的延迟，该效应可能与CRF信号通路有关。

VLM可以投射到LC区域[16]，LC与PVN之间也有纤维联系[17]。电生理学研究表明，侧脑室注射CRF或LC注射CRF，LC去甲肾上腺素神经元对疼痛刺激的反应加强。各种应激，如束缚、休克、低血压、腹部手术均会增加LC区去甲肾上腺素表达[4,8,12,18]。结果提示，LC中nesfatin-1神经元的激活可能与腹部手术后胃肠梗阻的发生有关。

总之，腹部手术可激活PVN大细胞区及前侧小细胞区、SON、LC、rRPa、EW、VLM及NTS中大部分nesfatin-1神经元，表明腹部手术诱导的nesfatin-1神经元激活可能对进食和胃排空的减弱有潜在调控作用。

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The Effect of Abdom inal Su rgery-induced Postoperative Ileus on Nesfatin-1 Exp ression in the Rat Brain

W u Qingjie,Hu Shasha,Pang M ingjie,etc.
(Qingdao University MedicalCollege,Qingdao 266021,Shandong;*Qingdao MunicipalHospital,Qingdao 266011,Shandong)

Ob jectiveTo investigate the effectof abdominal surgery-induced postoperative ileus on nesfatin-1-immunoreac⁃tive(ir)neuronsexpression in the ratbrain and the clinical significance.M ethodsRatswere anesthesiaed w ith Sulfuric acid butabar⁃bitaland abdom inal surgery was performed.Two hours after abdom inal surgery,ratswere transcardially perfused and brains processed for double immunohistochemical labeling of Fos and nesfatin-1.Resu ltsAbdominal surgery,induced an obvious increase of c-Fos expression in neurons of the supraoptic nucleus(SON)(P＜0.01),paraventricular nucleus(PVN)（P＜0.01),locus coeruleus(LC)(P＜0.05),Edinger-Westphal nucleus(EW)(P＜0.01),rostral raphe pallidus(rRPa)(P＜0.05),nucleus of the solitary tract(NTS)(P＜0.01) and ventrolateralmedulla(VLM)(P＜0.01),but the expression of nesfatin-1-immunoreactive cells did notdiffer(P＞0.05).The statisti⁃calanalysisshowed thatamong the actived c-Fosneurons,99%in the SON,71%in the anterior parvicellular PVN,47%in the lateral magnocellular PVN,41%in themedialmagnocellular PVN and 9%in themedial parvicellular PVN could expression nesfatin-1;in the hindbrain,abdom inal surgery activated nesfatin-1 neurons91%in the LC,82%in the rRPa,74%in the EW and VLM,14%in the NTS could expression c-Fos.ConclusionAbdom inal surgery can activate the nesfatin-1-ir neurons in the hypothalam ic and hind⁃brain food related nucles,and suggesta possible implication in the controlof food intake and gastric emptying disorder.

Abdominalsurgery;Fos;Hypothalamus;NUCB2;Postoperative ileus;Ratbrain

R574.2；R393

A

1008-4118（2014）02-0006-04

2014-03-26

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.02.02

武庆杰，（1983-）男，现在菏泽医学专科学校工作。

徐珞，E-mail:xu.luo@163.com

国家自然科学基金（No.81100260，No.81270460 and No.81300281）；青岛市科技局项目（13-1-4-170-jch）