长期注射水杨酸钠大鼠ABR及下丘谷氨酸脱羧酶-67表达的变化*

吴莎 华清泉 杨琨 肖伯奎 张志敏

阿司匹林类药物的主要成分是水杨酸钠，是临床常用的解热、镇痛、抗风湿类药物，在心血管疾病的预防中起到重要作用[1]。该药在治疗疾病的同时，高剂量使用也会产生明显的毒副作用，听力下降、耳鸣及言语认知能力的降低是水杨酸钠耳毒性的三大主要症状[2]。多年来，学者们从听觉系统的不同层面探讨了水杨酸钠耳毒性的机制，包括耳蜗(形态学改变、电生理学以及生化等方面的改变)、蜗神经(听神经复合动作电位、单根耳蜗神经纤维自发放电活动、耳蜗神经电生理活动的平均谱等)以及耳蜗核、下丘和听皮层的神经元放电和神经递质等方面的研究[3～9]，然而，至今水杨酸钠耳毒性具体机制仍在探索中。

研究表明水杨酸钠能够改变听觉中枢系统兴奋性，听觉中枢兴奋性神经递质与抑制性神经递质的失衡与水杨酸钠所致耳毒性作用关系密切[10]。下丘是中枢听觉系统的重要结构之一，具有精密加工和处理复杂听觉信息的功能。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，通过与其特异性受体结合产生抑制性突触后电位，谷氨酸脱羧酶(GAD)是GABA生成的关键酶，在体内催化兴奋性神经递质谷氨酸(Glu)转化生成GABA[11]，GAD67作为GAD的亚型之一，负责维持GABA基本水平[12]。为此，本研究拟观察长期注射水杨酸钠对大鼠下丘GAD67蛋白表达的影响，探讨其在水杨酸钠致耳鸣、听力下降中的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物分组及处理 选择健康成年Wistar大鼠18只(由湖北省预防科学院动物实验中心提供)，雌雄不限，体重200～300 g，耳廓反应灵敏、无中耳感染、强噪声暴露及耳毒性药物使用史。适应性饲养一周后，将实验动物随机分为水杨酸钠组(6只)、生理盐水组(6只)、对照组(6只)。将水杨酸钠(Sigma公司，S2679)溶于生理盐水中配成10%溶液，水杨酸钠组实验动物肌肉(后腿)注射水杨酸钠175 mg/kg，2次/天，时间间隔8小时，连续注射28天[6,13]；生理盐水组每天相同时间及部位注射等量生理盐水，连续注射28天；对照组实验动物不予处理。

1.2ABR检测 造模结束后，三组大鼠采用美国TDT系统进行ABR检测。大鼠经2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，保持肛温37 ℃并置于隔声屏蔽室内进行检测。选用短声(click)作为刺激声，单耳给声刺激，耳机发声窗距外耳道口1 cm，刺激速率为21次/秒，带通滤波100～3 000 Hz，观察时程为10 ms，叠加次数1 024次。记录电极置于两侧外耳道口与颅正中线交叉处皮下，参考电极置于同侧耳乳突皮下，接地电极置于鼻尖正中皮下。测试声响从110 dB SPL开始，以5 dB SPL逐次递减，以波Ⅲ最后消失的上一强度作为ABR反应阈，记录ABR反应阈及90 dB SPL时波Ⅲ潜伏期。

1.3Western blot检测下丘GAD67蛋白表达 ABR检测后将三组大鼠断头处死并在冰盘中迅速剥离下丘，-80 ℃冰箱保存。各组标本分别加入适当体积组织裂解液后冰上彻底匀浆，离心后取上清液。采用Bradford方法测定蛋白浓度，各组取总蛋白40 μg经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液室温封闭1小时，将PVDF膜浸泡于兔抗鼠GAD67多克隆抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗涤5 min×3次，加入HRP标记羊抗兔二抗(1∶3 000)室温下孵育30分钟，TBST洗涤5 min×3次，在暗室内加入ECL化学发光底物曝光，最后用显影、定影试剂进行显影和定影。选用β-action作为内参照，并用图像分析系统分析结果，比较各组下丘GAD67蛋白与β-action光密度比值。

1.4统计学方法 数据采用SPSS17.0统计学软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组动物ABR检测结果 水杨酸钠肌肉注射28天后，水杨酸钠组ABR波形分化较差，各波振幅下降。水杨酸钠组、生理盐水组、对照组ABR反应阈及波Ⅲ潜伏期见表1，可见，水杨酸钠组ABR反应阈较生理盐水组、对照组明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)；水杨酸钠组波Ⅲ潜伏期较生理盐水组、对照组明显延长，差异有显著统计学意义(P<0.01)；生理盐水组ABR反应阈、波Ⅲ潜伏期与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组动物下丘GAD67蛋白表达结果 Western

表1 三组大鼠ABR反应阈及波Ⅲ潜伏期比较

注：*与生理盐水组、对照组比较，P<0.01

blot检测结果显示，实验各组均表达相对分子量约为67 kDa的GAD67蛋白。与生理盐水组、对照组比较，水杨酸钠组下丘GAD67蛋白表达升高，差异具有显著统计学性意义(P<0.01)，而生理盐水组与对照组下丘GAD67蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(图1，表2)。

图1 Western blot检测下丘GAD67表达

表2 三组大鼠下丘GAD67蛋白与β-action的光密度比值

注：与生理盐水组、对照组比较，P<0.01

3 讨论

阿司匹林广泛应用于临床，至今约有150年的历史。研究发现大剂量服用此类药物(血药浓度超过30 mg/dl)后，可导致患者出现听力下降及耳鸣[14]。同样，动物研究显示长期注射水杨酸钠可致实验动物ABR各波振幅下降、反应阈升高且潜伏期延长[15]。本研究结果显示，水杨酸钠组动物肌肉注射水杨酸钠28天后ABR反应阈较生理盐水组、对照组明显升高，波Ⅲ潜伏期明显延长；而生理盐水组与对照组ABR反应阈及波Ⅲ潜伏期无明显差异，与上述报道一致，说明长期注射水杨酸钠能够导致大鼠听功能损伤。

在中枢听觉系统中，兴奋性神经递质与抑制性神经递质的平衡是维持正常听觉的重要因素，当其平衡受到影响时势必影响听觉信号的正常输入，导致听觉障碍。GABA作为抑制性神经递质广泛存在于中枢神经系统中，在信号传递过程中起着重要的作用，可通过与其特异性受体结合发挥抑制性效应。研究指出水杨酸钠可导致GABA发生下调使听觉中枢抑制性效应减弱，兴奋性效应增加，从而导致中枢听觉系统神经活动增强[16]而发生耳鸣。GAD是GABA合成的重要限速酶，在体内催化谷氨酸(Glu)转化为GABA，并直接影响脑组织中GABA的浓度，其在哺乳动物大脑中存在分子量分别为65 kDa、67 kDa两种亚型，即GAD65、GAD67[12]。GAD65可能作为一种惰性储备，提供GABA生成的短期需求；而GAD67则可能为机体提供更为长程的生理调节[17]，GAD表达的上调被认为是使GABA能神经元抑制性功能增加而发生的代偿性反应[18]。Bauer等[19]在动物实验(8 mg/ml，连续4月)中发现，长期口服水杨酸钠后GAD蛋白在动物下丘中表达上调，而在非听觉结构中，GAD蛋白表达无明显改变。本研究结果显示，水杨酸钠组动物下丘GAD67蛋白表达较生理盐水组、对照组明显升高，而生理盐水组与对照组GAD67蛋白的表达无明显差异，说明长期肌肉注射水杨酸钠能够导致大鼠下丘GAD67蛋白表达水平升高。推测在长期肌肉注射水杨酸钠的过程中，听觉通路持续性兴奋，机体通过上调GAD67蛋白表达，作为负反馈以代偿去抑制(GABA所介导抑制作用的降低)所引起的兴奋与抑制的失衡状态，促进抑制性效应的产生。

综上所述，本研究结果表明长期注射水杨酸钠能够引起大鼠听力下降及下丘GAD67蛋白表达上调。GAD67蛋白表达水平的升高极有可能作为一种机体对水杨酸钠引起耳毒性的一种抑制性代偿反应和调节机制，其调节的具体机制有待进一步研究。

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