GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗凋亡相关基因表达差异研究△

崔小缓 张延平 张晓强 李丽娜 蒋兴旺

研究发现 50 %的家族性遗传性常染色体隐性非综合征性聋(nonsyndromic hearing loss , NSHL) 以及 15 %～30 %的散发 NSHL 都可检测到 GJB2 基因突变[1]，至今，已证明有120多种不同的GJB2基因突变与NSHL有关[2]。在未成年NSHL患者中GJB2基因突变的阳性检出率高达20. 1 %[3]，因此该基因突变是导致人类NSHL的主要原因之一[4]，但其致病机制尚不清楚。

至今有三种GJB2基因条件敲除小鼠报道,即cCx26OtogCre(Cx26loxP/loxP_OtogCre)[5]、 cCx26Pax2Cre( Cx26loxP/loxP_Pax2Cre)[6]和cCx26foxg1Cre(Cx26loxP/loxP_foxg1Cre)[6]。这些模型动物在听功能发育成熟后出现耳蜗细胞的大面积缺失，前期研究结果提示cCx26OtogCre小鼠在P17时半胱天冬酶3(caspase-3)表达阳性[5]，在P18时耳蜗外毛细胞出现典型的凋亡表现[7]，提示其毛细胞凋亡可能是GJB2基因敲除后耳蜗细胞缺失的主要原因，但是目前有关细胞凋亡的具体机制尚未见报道。为了进一步探索GJB2基因突变导致耳蜗细胞凋亡的机制，本研究采用定量反转录聚合酶链反应芯片(QRT-PCR Array)技术对cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗膜迷路细胞中凋亡相关的84个基因差异性表达情况进行分析，探讨GJB2基因突变导致耳聋的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 转基因小鼠Cx26loxp/loxp和Pax2-Cre/+从美国Emory大学林曦教授实验室引进，cCx26Pax2Cre小鼠由Cx26loxp/-_Pax2Cre/+和Cx26loxp/loxp小鼠杂交产生。cCx26Pax2Cre小鼠为实验组，野生型BALB/C小鼠作为正常对照组，两组各选取P10和P18小鼠各3只进行实验。本实验动物的实验方法得到309医院动物饲养和使用委员会批准。

1.2主要试剂和仪器 RNeasy®Microarray Tissue 试剂盒、RNase-Free Dnase试剂盒、RT2 First Strand试剂盒、RT2Profiler PCR Array 试剂盒均为美国凯杰公司产品。所用的实时荧光定量PCR仪为美国Applied Biosystems公司生产。

1.3QRT-PCR Array检测耳蜗膜迷路凋亡相关基因的差异性表达方法 取野生型或cCx26Pax2Cre小鼠，麻醉后断头取耳蜗，解剖显微镜下打开耳蜗骨质取耳蜗膜迷路立刻放进裂解液中，充分研磨，按照凯杰公司的试剂盒说明书提取RNA，测定RNA浓度和纯度；再行反转录生成cDNA，应用QRT-PCR Array进行实时定量PCR检测。

1.4统计学方法 首先将数据转换成Excel文件，上传至凯杰公司网站(http://www.sabiosciences.com)，进行数据分析和图形绘制。数据分析采用△△Ct方法，通过2-△△Ct计算比较每组对应基因表达差异，应用student T-test可信区间为95%,P<0.05且上述基因表达差异在2倍以上为表达差异具有生物学意义。

2 结果

2.1P18与P10野生型小鼠耳蜗膜迷路凋亡相关基因差异性表达比较 P18较P10时野生型小鼠耳蜗膜迷路有7个凋亡相关基因表达出现下调(8.33%，7/84)(表1)，Bak1、Bok、Casp2、Ltbr为促进细胞凋亡相关基因(57%，4/7)，CD40，Bcl2l10、Bnip3l为抑制细胞凋亡的基因(43%，3/7)。

表1 不同膜迷路凋亡相关基因在P18与P10小鼠表达的差异倍数

2.2cCx26Pax2Cre小鼠与野生型小鼠耳蜗膜迷路凋亡相关基因差异性表达比较(表2) 与野生型小鼠相比，在P10时，cCx26Pax2Cre小鼠一共有16个基因表达有生物学意义(19.05%, 16/84)，其中14个基因表达下调(87.5%, 14/16)，包括9个(Bcl2l10、Naip1、Naip2、Birc3、Birc5、Hells、Nol3、Pak7、CD40)抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的基因(64%，9/14)，5个(Casp1、Casp12、Casp14、Tsc22d3、Trp53inp1)促进细胞凋亡和促进炎症反应的基因(36%，5/14)；2个基因(Dapk1，Tnfsf10b)表达上调(12.5%，2/16)，均为促进细胞凋亡的基因(100%，2/2)，此期促进细胞凋亡的趋势十分明显。在P18时，与野生型小鼠相比，cCx26Pax2Cre小鼠一共有4个基因(4.76%，4/84)表达变化有生物学意义，其中3个基因表达下调(75%，3/4)，并且全部为抑制细胞凋亡的基因(Bcl2l1、Bcl2l10、Cd40lg)，1个基因(Tnfrsf10b )表达上调(25%，1/4)，为促进细胞凋亡的基因，总体趋势仍为促进细胞凋亡的发生。

表2 不同时期耳蜗凋亡相关基因在cCx26Pax2Cre与野生型小鼠表达的差异倍数

注：※该基因表达在两个时间点均变化

表3 凋亡相关基因在P18与P10小鼠表达的差异倍数

2.3P18与P10 cCx26Pax2Cre小鼠凋亡相关基因差异表达比较 与P10相比，P18 cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗膜迷路凋亡相关基因表达变化有生物学意义的有6个基因(7.14%，6/84)，其中2个基因表达上调(33.3%，2/6)，分别为抑制细胞凋亡的Nol3和促进细胞凋亡的caspase-8基因，4个基因表达下调(66.7%，4/6)，分别为促进细胞凋亡的Tnfrsf10b、Cideb基因(50%，2/4)和抑制细胞凋亡的CD40、Bcl10基因(50%，2/4)(表3)。

3 讨论

基因敲除小鼠是研究基因突变致病机制的良好工具，有研究对cCx26OtogCre小鼠TUNEL标记耳蜗后进行观察，提示从 P14开始，Corti 器细胞标记阳性，从内毛 细 胞 的 支 持 细 胞 开 始 逐 渐 蔓延到外毛细胞的支持 细 胞， 然后是外毛细胞以及其他细胞，并且P17小鼠耳蜗中检测到caspase-3表达阳性[5]。张延平等[7]用异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽(fluorescein isothiocyanate-phalloidin，FITC-phalloidin)及碘化丙啶(propidium iodide，PI)对cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗基底膜染色，发现P18小鼠耳蜗外毛细胞出现典型的凋亡表现，上述结果都提示GJB2基因条件敲除后小鼠耳蜗细胞缺失可能主要以凋亡的形式表现。

凋亡相关的84个基因存在于凋亡三大通路中，其中55个是促进凋亡基因，29个为抑制凋亡的基因，这些基因的表达变化可以较为全面地反应组织中细胞凋亡的发生情况。Hu等[8]应用QRT-PCR Array技术对噪声暴露后大鼠耳蜗感觉上皮细胞和外侧壁(螺旋韧带、螺旋凸和血管纹)凋亡相关84个基因表达变化进行分析；Wei等[9]也应用此项技术对水杨酸干预后的大鼠耳蜗螺旋神经节凋亡相关84个基因表达变化进行了分析。由此可见这项技术用于动物模型耳蜗凋亡相关基因的筛查已经比较成熟。P9是小鼠耳蜗出生后发育的关键时期，此时柯替氏隧道打开，耳蜗发育趋于成熟。前期研究发现cCx26Pax2Cre小鼠 P18 时外毛细胞出现了典型的细胞凋亡表现[7]，因此，本研究应用QRT—PCR Array技术选择动物耳蜗形态学表现刚有差异的P10与细胞出现典型凋亡现象的P18两个时间点对其耳蜗膜迷路凋亡相关的84个基因表达差异性进行研究，以探讨GJB2基因突变导致耳聋的机制。

本研究显示，P18野生型小鼠较P10时耳蜗膜迷路有7个调亡相关基因表达下调，包括4个促进细胞凋亡相关基因、3个抑制细胞凋亡的基因。提示野生型小鼠耳蜗膜迷路细胞在发育过程中可能存在细胞凋亡现象，可能在P9时耳蜗螺旋器柯替氏隧道打开，把不需要的细胞舍弃，形成正常的听功能过程；而促进细胞凋亡的基因出现表达下调可能提示在P18时野生型小鼠耳蜗膜迷路细胞内环境趋于稳定，这与形态学研究发现此时期野生型小鼠耳蜗膜迷路发育基本成熟相一致。

文中结果显示，与野生型小鼠相比，P10 cCx 26Pax2Cre小鼠有生物学意义差异的表达基因数较多，且促进细胞凋亡的趋势十分明显，P18时细胞凋亡相关基因表达差异数较P10时明显减少，主要趋势仍为促进细胞凋亡，且所有的基因表达差异均促进了细胞凋亡的发生，这可能与此期耳蜗外毛细胞出现典型的凋亡缺失有关。Bcl2l10和Tnfrsf10b基因在P10和P18两个发育阶段的变化均具有生物学意义，Bcl2l10编码的蛋白具有抑制细胞凋亡的作用，在两个阶段均下调；Tnfrsf10b编码的蛋白主要生物学功能为促进细胞凋亡，在两个阶段均上调，提示可能Bcl2l10和Tnfrsf10b这两个基因在cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗膜迷路细胞凋亡过程中起重要作用。

本研究显示，P18 cCx26Pax2Cre小鼠较P10时促进细胞凋亡的趋势减弱，可能是cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗膜迷路细胞在P18时出现了凋亡相关基因表达重新整合，使细胞的内环境趋于新的平衡。然而此期促进细胞凋亡的caspase-8仍表达上调2倍以上(P<0.05)，提示caspase-8在cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗膜迷路细胞凋亡过程中可能起重要作用。

Tnfrsf10b编码DR5,属于肿瘤坏死因子受体(tumor nercrosis factor receptor, TNFR)超家族成员，其与相应配体结合引起前者寡聚化而被激活，被激活的死亡受体招集FADD(Fas-associated death domain, FADD)分子诱导凋亡。FADD通过两个DD之间的互相作用于受体，通过DED之间的相互作用募集Caspase-8(Pro-caspase-8)，最后形成一个死亡信号复合体(death-inducing signaling complex，DISC )[10],在DISC内，Pro-caspase-8被激活，形成Caspase-8，进而引起细胞凋亡。现在研究者普遍认为[11]Caspase-8引发凋亡主要通过两个途径，即非线粒体依赖途径和线粒体依赖途径。Bcl2l10是BCI-2家族最近被发现的蛋白成员，研究认为Bcl2l10编码的蛋白主要作用为抑制细胞凋亡；Bcl2l10基因过表达，可能通过阻止cytochrome C激活Caspase-3抑制细胞凋亡。有研究发现Bcl2l10减少可以通过B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白(B cell lymphoma factor related protein X,BAX)途径导致细胞凋亡[11]。

本研究发现Tnfrsf10b和Bcl2l10基因在小鼠出生后的P10和P18均出现一致性上调或下调，而且与P10相比，P18时cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗组织Caspase-8表达明显增加，推测DR5与Pro-caspase-8形成DISC后活化Caspase-8并最终通过死亡受体途径直接引起细胞凋亡，而同时caspase-8被激活后裂解Bid[BH interacting (with BCL 2 family) domain,BCL2家族BH作用结构域]使得有活性的截短Bid(truncated Bid,tBid)生成增加，tBid增加和Bcl2l10表达下调都导致Bax表达上调，激活线粒体通路导致细胞色素C(cytochrome C,Cyto C)和Smac/DIABLO释放，Cyto C释放入胞浆, 与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor,Apa-f1)、pro-caspase-9形成凋亡体, 使得pro-caspase-9自身催化形成有活性的Caspase-9, 进而活化效应Caspase-3、Caspase-7，最终导致细胞凋亡。GJB2基因敲除后，可能通过上调DR5，直接激活凋亡通路的死亡受体途径导致细胞凋亡，也可能通过Caspase-8间接激活线粒体通路使凋亡信号进一步放大，最终引起cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗细胞的广泛缺失和听力下降。有关DR5导致GJB2基因敲除小鼠耳蜗细胞凋亡的确切机制还需要进一步实验验证。

4 参考文献

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