鼓阶微孔注入盐酸椒苯酮胺对豚鼠庆大霉素耳蜗损伤的保护作用*

陈浩 谢民强 吴剑 李威 李永贺

耳毒性药物损伤是导致感音神经性聋的常见因素。氨基糖苷类(aminoglycoside antibiotic，AmAn)药物庆大霉素属于耳毒性药物，临床应用广泛，因其大剂量易致聋[1]，也常用于制造耳蜗损伤动物模型。研究认为，AmAn产生过量氧自由基(oxygen-derived free radicals ，OFR)损伤耳蜗[2]是其可能的机制之一。盐酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride, PPTA)是我国自主研发拟应用于心血管保护的新型钙增敏剂，临床研究提示，其具有清除心肌再灌注损伤时产生的OFR，抑制脂质过氧化反应的作用[3]。目前尚缺乏PPTA应用于耳蜗的研究，为排除其影响耳蜗供血和经全身代谢后对耳蜗组织生化指标检测的干扰，本研究拟通过鼓阶开窗微孔技术将PPTA注入耳蜗内，观察其对庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤后的听功能、耳蜗组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)、毛细胞的形态学改变的影响，探讨PPTA对耳蜗损伤的保护作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 成年健康白色红目豚鼠45只，体重250～300 g，雌雄不拘，耳廓反射灵敏，鼓膜完整并均经ABR筛查排除了听力异常，由南方医科大学实验动物中心提供(动物证编号：44002100000038)。将豚鼠编号后按随机化原则分为空白对照组、GM组和PPTA组每组各15只。

1.2主要试剂及仪器 GSH试剂盒A006-1(100T/96样), SOD试剂盒 A001-1(羟胺法)(南京建成生物工程研究所)；BCA法蛋白定量试剂盒(北京北泰克生物技术有限公司)；硫酸庆大霉素注射液(广州白云山天心制药有限公司，批号国药准字H44022095)；人工外淋巴液(南方医科大学实验中心配置)；PPTA溶液，将PPTA粉剂溶于3.5

LEICA M651手术显微镜(徕卡设备有限公司制造)；ZEISS耳科解剖显微镜(德国蔡司光学设备有限公司)；日本产HITACHI S-3000N冷切发射扫描电镜、H-7500透射电子显微镜(南方医科大学实验中心电镜室)；STORZ 250420B电钻，功率60 W(德国产)；FP-6200酶标仪(日本产)；隔声屏蔽室(南方医科大珠江医院耳鼻咽喉头颈外科听力中心)；手钻(自制)，显微镜下将针灸银针尖端1 mm打磨成三棱锥形制成；飞鸽牌微量进样器，25 μl(上海注射器三厂生产)。

1.3研究方法

1.3.1各组动物给药方法及剂量 空白对照组鼓阶开窗微孔注入人工外淋巴液10 μl/d，连续给药3天；GM组肌肉注射GM 160 mg·kg-1·d-1，连续注射3天；PPTA组鼓阶开窗微孔注入PPTA 10 μl/d，连续给药3天，同时，肌肉注射GM 160 mg·kg-1·d-1。

1.3.2鼓阶开窗微孔注药方法 豚鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(35 mg/kg)全身麻醉，双耳备皮，保温毯37 ℃保温，5%碘酊消毒手术部位，铺无菌巾单，0.5%盐酸利多卡因局部麻醉，在耳廓根部后下1/3距耳后沟0.5 cm处切开皮肤，分离肌肉组织，显露颞骨乳突部，耳科电钻(0.8 mm小钻头)在乳突上钻孔，孔径约2 mm，显微镜下孔内可见耳蜗底回和圆窗，以圆窗下缘下方1.2 mm，距耳蜗与鼓室壁交界处1.5 mm的耳蜗底回用自制“耳蜗手钻”旋转钻出直径约0.2 mm微孔，即进入鼓阶。由微孔插入灌注针头，入鼓阶深<0.2 mm，微量注射器将10 μl PPTA(PPTA组)或等量人工外淋巴液(空白对照组)缓慢注入鼓阶内，并用肌浆和少许耳脑胶封闭骨孔。切口缝合后用创可贴包扎。

1.3.3听性脑干反应检测 三组动物分别在用药前、第3天用药后测试听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)。测试在隔声屏蔽室内进行，以1%戊巴比妥钠溶液(35 mg/kg)对动物进行腹腔注射麻醉。测试采用南方医科大学珠江医院听力中心的“听觉电生理动物实验平台”测听系统[4]。用短银针(自制，极间阻抗<2 000 Ω)刺入豚鼠皮下作电极，颅顶双耳连线正中点为记录电极，受试耳后乳突皮下为参考电极，对侧耳后乳突皮下为接地电极。耳机离受试耳外耳道口0.5 cm。用单周正弦波短声(click)刺激，采样重复频率11.1次/s(刺激间隔90 ms)，交替起始位相以消除伪迹，滤波带通100～3 000 Hz，叠加次数256～512次，分析时程20 ms，声刺激重复率15 Hz，放大倍数100 000倍，刺激声强级的增减为5 dB SPL。对侧加低强度白噪声(低于刺激声20 dB SPL)掩蔽。以波Ⅲ确定豚鼠ABR的反应阈(respond threshold，RT)，每只豚鼠反复测量三次取平均值作为该豚鼠RT。

1.3.4各组豚鼠耳蜗组织提取 最后一次ABR检测结束后，各组豚鼠均断头处死，断头置于冰台上，生理盐水冲洗，迅速分离每只豚鼠的双侧颞骨，取听泡，打开听泡，暴露鼓室，分离耳蜗，在解剖显微镜下去除镫骨并刺破圆窗膜，蜗尖朝上，在蜗顶钻孔，用微量注射器从蜗尖小孔缓慢注入PBS缓冲液，直至液体从从前庭阶和鼓阶流出。以分离针和小刀片剥离蜗壳，剔除骨迷路，一侧组织留用SOD、GSH检测。

1.3.5耳蜗组织SOD活力及GSH含量检测 采用南京建成生物工程研究所SOD试剂盒 A001-1(羟胺法)和GSH试剂盒A006-1(100T/96样)。取各组一侧耳蜗组织置于冰台上，预冷生理盐水按重量体积比1:9，冰浴下用电动匀浆机匀浆，制成10%耳蜗组织匀浆，3 000转/min离心10分钟，-20 ℃保存，组织蛋白浓度测定用BCA法，SOD、GSH测定按试剂盒步骤进行。蛋白冷却到室温后，用酶标仪测定A562，或540～590 nm 之间其他波长吸光度，根据标准曲线和公式计算总SOD活力(酶计算的为活力，单位U/mgprot，mgprot为毫克蛋白数)。根据实验做出的标准曲线计算GSH浓度，单位Ggsh/L。

1.3.6扫描电镜(SEM)标本制备 取各组豚鼠另一侧耳蜗中的7个耳蜗制作SEM标本。用2.5%戊二醛由蜗尖向圆窗轻轻灌注10～15次后置于2.5%戊二醛固定液中固定24 h(控温4 ℃)。标本放入临界点干燥仪内进行干燥，液态CO2作置换液；将干燥后的标本在显微镜下用导电胶粘到铜座上，离子溅射仪镀膜,扫描电镜观察。

1.3.7透射电镜(TEM)标本制备 取上述剩余8个耳蜗组织做TEM标本。TEM样品的制备需要经过耳蜗内1% 多聚甲醛和2% 戊二醛1:1 混合液灌流后，置于该混合液中4 ℃过夜；解剖显微镜下剥去耳蜗外壳，经过漂洗、后固定、脱水、脱钙、锇酸后固定，包埋，切取半薄切片及60 nm左右的超薄切片。透射电镜观察耳蜗组织等超微结构。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析。用协方差分析方法，若实验前ABR反应阈对实验后无影响，对实验后数据进行单因素方差分析，若满足方差齐性，用LSD比较组间差异；若不满足方差齐性，用Welch法矫正，用Dunnet’s T3比较组间差异。计算概率值(P)显示差异性，以P<0.05作为差异显著性的判断标准。

2 结果

2.1各组动物ABR反应阈比较 各组动物实验前后ABR反应阈比较见表1，可见空白对照组实验前后ABR反应差异无统计学意义(P>0.05)；用药3天后GM组和PPTA组ABR反应阈明显高于空白对照组(P<0.001)，PPTA组ABR反应阈显著低于GM组(P<0.001)。

表1 三组动物实验前后ABR 反应阈值比较

注：*与空白对照组比较，P<0.01;#与GM组比较，P<0.01

2.2各组动物用药3天后耳蜗组织中SOD和GSH检测结果 GM组耳蜗组织SOD活力显著低于空白对照组(P<0.001)和PPTA组(P<0.001)，PPTA组耳蜗组织SOD与空白对照组差异无统计学意义(P=0.121)。三组间耳蜗组织GSH含量差异有显著统计学意义(F=170.740,P<0.001)，PPTA组耳蜗组织GSH显著高于GM组(P<0.001)，但低于空白对照组(P<0.001)(表2)。

表2 各组用药3天后SOD活力和GSH含量比较

注：*与空白对照组比较，P<0.001;#与GM组比较，P<0.001

2.3各组动物耳蜗扫描电镜结果 扫描电镜观察可见空白对照组耳蜗的三排外毛细胞纤毛直立，排列整齐，V型，无倒伏、缺失；内毛细胞排列整齐，无纤毛和胞体缺损(图1a)。GM组耳蜗最外排外毛细胞受损最严重，明显肿胀、倒伏、断裂，失去正常形态，损伤向内逐渐减轻，以底回最重，向上逐渐减轻，内毛细胞损伤较外毛细胞轻微(图1b)；PPTA组耳蜗的外毛细胞肿胀，部分倒伏、较少断裂缺失；内毛细胞排列整齐(图1c)。

2.4各组动物耳蜗透射电镜结果 透射电镜观察可见空白对照组豚鼠耳蜗外毛细胞呈试管状，形态正常，胞膜光滑完整，胞内无水肿、空泡和变性；内毛细胞胞呈杯状，核较外毛细胞大而圆(图2a)；GM组耳蜗毛细胞水肿样变性，线粒体肿胀，边集，胞膜轻微外凸，胞膜下可见出小空泡，核固缩或胞质消失，可见凋亡小体(图2b)；PPTA组耳蜗病变明显轻于GM组，毛细胞线粒体肿胀减轻，细胞形态基本正常(图2c)。

图1 各组动物耳蜗扫描电镜观察结果 a 空白对照组;b GM组;c PPTA组

图2 各组动物耳蜗透射电镜观察结果 a 空白对照组;b GM组;c PPTA组

3 讨论

感音神经性聋严重影响着人类身体健康和生活质量，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界近6亿人有轻度听力损失，中度以上约2.5亿[5]。我国有听障的残疾人近3 000万，居各类残疾之首。耳蜗损伤是感音神经性聋的主要病理改变，炎症反应、细胞钙超载、OFR等都可造成耳蜗损伤。OFR最外层的电子轨道上具有未配对电子，是生物体内氧分子不完全还原代谢的产物，主要包括超氧阴离子、羟自由基(·OH)和过氧化亚硝酸盐阴离子(ONOO-)等。OFR直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体生理病理过程，被认为是氧中毒、药物中毒等病理过程的基础[6]。AmAn致聋机制仍不十分清楚，随着对耳蜗损伤研究的深入[7]， 越来越多证据显示OFR参与了AmAn耳毒性的发生[8]，有证据显示经GM培养12 h耳蜗毛细胞出现大量的过氧化物阴离子[9]，提示OFR可能在GM致毛细胞早期损害中扮演重要角色。鉴于OFR在耳蜗损伤中的重要作用[10]，寻找OFR清除剂来治疗感音神经性聋具有重要的意义。

盐酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride,PPTA)系中国医学科学院药物研究所合成的钙增敏剂类原始创新化学药，具有增强心脏功能并降低心肌耗氧量的双重作用。其对心、脑组织的作用机制为清除损伤的心肌细胞氧自由基，抑制脂质过氧化反应[3]；清除脑细胞受损所产生的OFR，增加脑组织SOD活力和GSH含量[11]。前期研究显示[12]，PPTA对动物耳蜗缺血再灌注导致的听功能损伤具有保护作用。PPTA若通过传统方式全身用药，其对心脏功能、血液循环、肝肾代谢等影响可能会干扰实验中耳蜗组织SOD、GSH的检测，需要将PPTA直接导入耳蜗以排除对结果客观性和准确性的影响。近年来，鼓阶开窗已成为将基因、生长因子等导入耳蜗的重要途径，前期研究表明鼓阶开窗术对豚鼠听力无影响，不会导致耳蜗组织功能受损，可作为内耳给药的有效途径[13]。故本研究选择鼓阶开窗微孔注入技术将PPTA注入GM致聋豚鼠耳蜗，结果显示，空白对照组实验前后ABR反应阈无明显差异，提示鼓阶开窗微孔技术对听力无显著影响，实验后GM组ABR反应阈显著高于正常组，PPTA组ABR反应阈显著低于GM组，提示PPTA对耳蜗功能具有的保护作用。耳蜗是氧代谢非常旺盛的器官之一，毛细胞、血管纹等结构内质网和线粒体等产生大量OFR，所以PPTA对耳蜗的保护机制可能与其在心、脑组织中的作用类似。

SOD、GSH为机体维持氧化-抗氧化平衡的主要物质。SOD、GSH广泛存在于耳蜗血管纹、纤维细胞、毛细血管内皮细胞、螺旋韧带及前庭等部位，并主要由肝、肾合成、代谢。SOD是生物体内重要且最佳的OFR清除剂，其活性的高低间接反映组织清除OFR的能力，GSH为机体重要的解毒及抗氧化剂，除可与OFR结合、接受H使OFR的清除反应能够持续进行[14]外，还可利用其半胱氨酸上巯基(-SH)还原SOD。一般认为，OFR可能贯穿组织损伤的全过程，但因中晚期出现抗氧化物质耗竭，故本研究于给药3天后检测耳蜗组织中的SOD和GSH，有利于客观地分析耳蜗组织内OFR水平。结果显示，GM组SOD、GSH显著低于正常组，提示GM组耳蜗组织OFR增多，有研究认为GM可以和体内的铁离子形成具有较强氧化性的螯合物[15]而导致OFR过量增多，可能是本研究中GM组耳蜗中OFR增多的原因；PPTA组SOD、GSH显著高于GM组，说明该组动物SOD、GSH消耗量较GM组少，提示PPTA具有清除耳蜗组织过量OFR的作用；另外，PPTA组与空白对照组比较，SOD无显著差异而GSH降低，表明PPTA组可能有一部分SOD通过消耗GSH得到了补充。

从文中结果看，扫描电镜下可见空白对照组毛细胞排列整齐，纤毛直立并具有极性，支持细胞整齐，可见鼓阶开窗微孔技术并未对耳蜗组织造成明显影响；GM组外毛细胞损伤最为明显，以底回最重，向上逐渐减轻，这与GM最先导致高频听力损失相一致。毛细胞代谢旺盛是OFR主要集中的区域，扫描电镜观察显示底回毛细胞损伤最重，原因在于耳蜗底部代谢强于顶部，产生更多OFR，从形态学方面也佐证了GM对耳蜗的OFR损伤机制；PPTA组耳蜗主要表现为毛细胞纤毛的肿胀，紊乱，极性存在，极少见纤毛的断裂与缺失，其损伤程度明显轻于GM组，表现出PPTA对耳蜗毛细胞等良好的保护作用。有研究表明OFR可能既参与了耳蜗组织细胞的凋亡途径，也参与了耳蜗组织细胞的坏死途径[16]。从文中透射电镜结果看，GM组毛细胞泡状肿胀，线粒体肿胀、嵴结构消失、胞膜边集。这些表现可能与OFR破坏线粒体膜结构导致能量代谢异常并钙超载而产生细胞水肿有关；细胞膜皱缩，胞质减少，染色质凝聚在细胞核膜边缘形成新月体，还发现调亡小体结构。说明凋亡是GM耳毒性导致耳蜗细胞损伤死亡的一种重要方式；PPTA组除细胞部分空泡样变外，损伤表现并不显著，线粒体肿胀明显弱于GM组，表明PPTA对耳蜗组织细胞有良好的抗坏死和抗凋亡作用。

综上所述，OFR是GM导致耳蜗功能受损的重要原因，PPTA通过拮抗GM所致OFR损伤耳蜗的机制起到保护听力的作用。其可能机制为：①PPTA通过直接或间接清除OFR保护SOD活力，保护了组织抗氧化能力。②抗组织过氧化：GSH可结合OFR并将氧化后SOD等进行还原，其含量是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。③阻止了OFR引起的细胞凋亡和坏死，但具体机制还有待进一步探索。

4 参考文献

1 Gooi A，Hochman J，Wellman M，et al.Ototoxic effects of single-dose versus 19-day daily-dose gentamicin[J]．J Otolmyngol Head Neck Surg,2008 ,37：664．

2 Jiang H, Sha SH, Schacht J. Rac/Rho pathway regulates actin depolymerization induced by aminoglycoside antibiotics[J]. J Neurosci Res, 2006, 83: 1 544.

3 杨向阳,李若冰,万华印.新型钙增敏剂左西孟旦和盐酸椒苯酮胺研究进展[J].国际药学研究杂志,2010,37:32.

4 郭梦和，黄以乐.听觉电生理动物实验平台组合[J].听力学及言语疾病杂志，1999，7：100.

5 沈励，刘民.听力残疾的流行病学研究进展[J].中国康复医学杂志，2009，24：282.

6 顾景范,杜寿玢,查良锭,等．现代临床营养学[M]．北京：科学出版社，2003.320～333．

7 Murillo-Cuesta S, Contreras J, Cediel R, et al. Comparison of different aminoglycoside antibiotic treatments to refine ototoxicity studies in adult mice[J]. Lab Anim，2010,44:124.

8 Chen Y ，Huang WG， Zha DJ，et al．Aspirin attenuates gentamicin ototoxicity：from the laboratory to the clinic[J]．Hear Res,2007 ，226：178．

9 丁大连,Richard Salvi.氨基糖苷类抗生素耳毒性研究[J].中华耳科学杂志，2007，5: 125.

10 Kim HJ, Lee JH, Kim SJ. Roles of NADPH oxidases in cisplatin-induced reactive oxygen species generation and Ototoxicity[J] ．J Neurosei，2010，30：3 933．

11 朱汉祎,林焕冰,陈玉嫔,等.椒苯酮胺对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用[J].军事医学杂志,2011,4:286.

12 李永贺，李威，陈浩，等.盐酸椒苯酮胺对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤的听力保护作用[J].听力学及言语疾病杂志，2013，21：603.

13 李永贺，陈浩，郭梦和.鼓阶开窗微孔技术注入胰岛素样生长因子-1对庆大霉素致聋豚鼠的治疗作用[J].南方医科大学学报，2008，28：200.

14 Wang FM，Zhu XW, Ma YP，et al．Effects of low concentration of pentachlomphenol exposure on SOD activity，GSH and HSP70 content in rare minnow[J]．Asian Journal of Ecotoxicology，2009，4：415.

15 Sun H, Hashino E, Ding DL, et al. Reversible and irreversible damage to cochlear afferent neurons by kainic acid excitotoxicity[J]. J Comp Neurol,2001,430:172.

16 Tiang H，Sha SH，Forge Schacht J．Caspase-independent pathways ofhair cell death induced by kanamycin in vivo[J]．Cell Death Differ,2006，13：20．