甲醛降解菌的筛选及其生物特征研究

邹征强，王冬冬，赵小玉，刘阳松，胡勇，张娅

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

甲醛降解菌的筛选及其生物特征研究

邹征强，王冬冬，赵小玉，刘阳松，胡勇，张娅

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

从花溪河流污泥中筛选分离出一株甲醛降解菌，对其生长特性及甲醛降解特性进行了初步研究，得出该菌株的最适条件是:温度为30～40℃，pH值为6～8。在最适生长条件下，该菌株对甲醛的耐受浓度可达2 g/L，84 h内可将91.9%的甲醛降解。菌悬液超声破碎上清液能使溶液中甲醛浓度降低，由此推测菌株可能是通过分泌一种酶来降解甲醛的。

甲醛;筛选;降解菌

甲醛是一种无色、具有强烈刺激性的有毒气体。在我国有毒化学品优先控制名单上甲醛高居第二位，已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸性物质，是公认的变态反应源，也是潜在的强致突变物之一，具有强烈的致癌和促癌作用［1－2］。甲醛性质活跃，能发生氧化、还原、加成、聚合等反应，与蛋白质结合后会对呼吸道产生严重的刺激，引起水肿、眼刺痛、头痛，也可引发支气管哮喘［3－4］。体积分数为35%～40%的甲醛水溶液通称福尔马林，常用于实验标本的保存。在家具的制作、墙面、地面装饰铺设所使用的粘合剂中含有大量甲醛［5］。在化工等行业甲醛也具有重要作用。由于甲醛的广泛应用性和我们环保意识的薄弱，其已对我们的居住环境造成极大的破坏，严重危害人的身体健康。因此，如何消除环境中的甲醛污染十分必要。

目前，治理甲醛污染的方法主要有化学反应方法、物理吸附技术、臭氧负离子技术、纳米光催化技术、低温等离子技术、植物净化和微生物降解等方法［6］。其中微生物降解具有高效、低成本和无二次污染的特点，已得到环保人士的广泛认同。微生物降解甲醛的关键是要获得能高效降甲醛的菌株。黄赛花等［7］报道筛选获得了1株甲醛降解真菌黄曲霉Aspergillus spp.H4，该真菌在培养144 h内能使甲醛从1 241 mg/L下降到4 mg/L;Doronina等［8］研究的一株P.alcaligenes培养3 d后降解甲醛的能力达2 000 mg/L;Saeed等［9］报道的4株P.pseudoalcaligenes(LSW，SSW，NSW，OSS)降解甲醛的能力达1 850 mg/L。现阶段分离筛选到有实际利用价值的甲醛降解菌株的报道还很少，本研究试图筛选分离出能高效降解甲醛的菌株，为利用微生物降解甲醛提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从重庆理工大学花溪河下水道出口采集污泥，从中分离筛选得到能够以甲醛为唯一碳源的菌株，命名为菌株Z。

1.2 培养基及试剂

1.2.1 培养基的配置

富集培养基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值为7.4～7.6。

固体培养基:在富集培养基中加入20 g/L琼脂粉。

选择培养基:K2HPO40.5 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KCl 0.5 g，琼脂20 g甲醛(2 mg/mL)，蒸馏水1 000 mL，pH=6。

上述所有培养基都于121℃高压蒸气灭菌30 min。

1.2.2 试剂

乙酰丙酮溶液［10］:50 g乙酸铵、6 mL冰乙酸及0.5 mL乙酰丙酮试剂溶于100 mL水中。

1.3 试验方法

1.3.1 甲醛降解菌的筛选

1)将10 g土壤样品置于100 mL无菌生理盐水中，振荡10 min后静置，取10 mL上清液置于盛有100 mL富集培养基的锥形瓶中，然后加入200 μL甲醛(质量分数为37%～40%)，在150 r/min、30℃摇床上富集培养24 h，得富集培养菌悬液。

2)取适量菌悬液接种于装有10 mL基本培养基试管中，加入25 μL甲醛，置于150 r/min、30℃摇床上培养24 h，取培养24 h后的菌液接种于甲醛初始浓度为0.5 mg/mL的基本培养基中，在摇床上震荡培养。此后不断提高基本培养基中甲醛含量，并接种前次驯化的菌液，直至菌株不再继续生长［11］。

3)将甲醛含量最大的富集菌液连续10倍梯度稀释，取各稀释液0.2 mL分别接种至选择培养基，30℃恒温培养箱中培养2天，选取生长较好的菌落，并不断进行分离纯化，直至得到纯菌株，以保证菌株的高纯度及降解性的稳定。

1.3.2 菌株Z最适生长条件的研究

1)耐盐性

配置不同氯化钠浓度梯度(2%、4%、6%、8%、10%)的富集培养基，每个梯度设置3个平行，接种菌液，摇床上振荡培养48 h，测OD。

2)最适温度

分别设定20℃、30℃、40℃、50℃4个温度，每个温度设置3个平行，接种菌液，摇床上振荡培养48 h，测OD。

3)最适pH值

培养基pH值分别设定为5、6、7、8、9，每组设置3个平行，接种菌液，摇床上35℃振荡培养48 h，测OD。

1.3.3 菌株Z的形态、生化特征

将其划线接种于基本培养基上，30℃培养2 d后观察菌落形态特征;取培养20 h的菌落进行革兰氏染色，在油镜下观察菌株形态特征;糖发酵，淀粉、油脂和明胶水解实验按照文献［12］进行。

1.3.4 生长曲线的测定

将菌株Z接种在配有基本培养基的锥形瓶中，并在培养基中加入适量甲醛，同时设置不接菌的作为对照组，以便于测量甲醛挥发量。将锥形瓶置于35℃、150 r/min的摇床上振荡培养，每隔一段时间取样一次，然后运用分光光度计测定样品菌体的光密度值(OD 600 nm)［13］。100 h后根据OD值绘制出细菌的生长曲线。

1.3.5 甲醛降解率的测定

将加有200 mL基本培养基的锥形瓶灭菌后加入1 000 μL甲醛，此时甲醛浓度约为2 mg/mL，接入菌株Z做为实验组，同时将不接菌的培养基作为对照组。将两组锥形瓶放置于35℃、150 r/min的摇床上振荡培养，每隔12 h取样一次。取样后先将样品离心5 min(5 000 r/min)，再取上清液稀释，加入适量乙酰丙酮溶液于60℃恒温水浴下反应10 min，最后用分光光度计测定OD(412 nm)，利用标准曲线分别计算出甲醛浓度，绘制出甲醛降解曲线。

1.3.6 甲醛降解机制

为了确定细菌是非特异性与甲醛结合还是分泌某种酶来降解甲醛［14］，设计了以下实验:将菌株Z接种至选择培养基上培养48 h，超声波破碎、离心后，取上清液;将上清液加入含甲醛(1.5 mg/ mL)的溶液中，将其置于35℃的培养箱中，设置空白对照;分别在0、4、8、12 h定时取样，用乙酰丙酮法测定样品的OD值(412 nm)，检测溶液中甲醛浓度。

2 实验结果

2.1 甲醛降解菌的筛选纯化结果

应用平板划线法和系列稀释法从河流下水道污泥中分离筛选得到一株能以甲醛为唯一碳源的降解菌，即菌株Z。菌落形态如图1所示。菌落表面呈粘液样，光滑、凸起，大多呈完整的圆形;外观呈乳白色、有光泽，培养3天后菌落表面有2圈黄色物质生成。菌株Z为革兰氏染色结果为阴性，形态为短杆状。

图1 菌株Z菌落形态

2.2 生化特征

对菌株Z进行的生化特征测定，结果见表1。

表1 降解菌生化特征测定

2.3 最适生长条件

通过试验，菌株Z的最适生长温度为30～35℃，最适为pH值为6～8，NaCl浓度超过8%时，细菌不生长。

2.4 细菌生长曲线的测定结果

利用分光光度计测得降解菌生长曲线结果见图2。由生长曲线可以看出:0～12 h为延滞期，此时细菌主要的主要任务是使代谢系统适应环境的需要;12～60 h为对数期，此时生长最快;60～80 h细菌进入稳定期;80 h后光密度值(OD 600 nm)有所增大，即细菌密度略有所增加，有可能出现二次生长的迹象。

图2 菌株Z生长曲线

2.5 甲醛降解率的测定结果

用分光光度计测定OD值，绘制甲醛降解曲线，结果见图3。由图3可知，随着培养时间的延长，甲醛降解率逐渐增大，84 h后，降解效率为91.9%，说明细菌对甲醛有良好的降解效果。在25～35 h内，细菌对甲醛的降解速率最快，与图3生长曲线相比较，此时细菌处于对数生长期，说明细菌在生长期需大量利用甲醛来供其生长繁殖。

图3 甲醛降解曲线

2.6 细菌降解甲醛机制

菌株降解甲醛机制的研究结果见图4。由图4可知，空白组吸光度几乎不变，而实验组吸光度明显降低，说明降解菌并不是非特异性地将甲醛吸附于菌体表面，而是释放了某种内源性或外源性物质来降解利用甲醛，继而使培养基甲醛浓度降低。

图4 细菌分泌酶降解甲醛曲线

3 结论

从河流下水道污泥筛选出一株能降解甲醛的细菌，该菌株为革兰氏阴性短杆菌，能高耐甲醛并以甲醛为唯一碳源。其最适生长温度为30～40℃，最适pH为6～8。细菌通过合成某种内源性或者外源性物质来降解甲醛。当在以甲醛为唯一碳源时，其降解效率为91.9%，能将甲醛降解到0.05 mg/mL以下。更为重要的是，对其降解机制的初步研究，结果表明菌株Z通过释放某种酶来降解甲醛。

利用微生物来降解甲醛，不但能高效地去除甲醛，而且不会造成二次污染，环保节能，是治理甲醛污染的有效途径，具有十分重要的应用价值。

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(责任编辑 何杰玲)

Isolation and Biological Characteristic of Bacterial Strain Capable to Metabolize Formaldehyde

ZOU Zheng－qiang，WANG Dong－dong，ZHAO Xiao－yu，
LIU Yang－song，HU Yong，ZHANG Ya
(School of Pharmacy and Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China)

One biological strain capable to degrade and metabolize formaldehyde was isolated from the sludge of Huaxi river.Meanwhile，the growth characteristics and formaldehyde degradation characteristics of the strains were preliminarily studied.The optimal condition of growth was determined as the follows:incubation temperature of 30～40℃and pH value of 6～8.In optimal conditions，the tolerance to formaldehyde concentration of the strain up to 2 g/L，and the removal efficiency of formaldehyde can be as high as 91.9%in 84h.The formaldehyde concentration in the solution can be reduced by the supernate of ultrasound broken bacteria，which suggests the strain may degrade formaldehyde by secreting an enzyme.

formaldehyde;screening;degrading bacteria

Q93

A

1674－8425(2014)03－0077－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.03.014

2013－09－20

重庆理工大学生物医学工程重点学科资助项目(0110121221－30277)

邹征强(1990—)，男，江西人，主要从事微生物与生化药学方面研究;通讯作者胡勇(1970—)，男，四川人，副教授，主要从事微生物与生化药学方面研究。

邹征强，王冬冬，赵小玉，等.甲醛降解菌的筛选及其生物特征研究［J］.重庆理工大学学报:自然科学版，2014(3):77－80.

format:ZOU Zheng－qiang，WANG Dong－dong，ZHAO Xiao－yu，et al.Isolation and Biological Characteristic of Bacterial Strain Capable to Metabolize Formaldehyde［J］.Journal of Chongqing University of Technology: Natural Science，2014(3):77－80.