产不同色素古尼拟青霉菌株功效成分分析*

贾学渊，郭 瑞，虞 泓，陈自宏，曾文波，杨俊媛

(云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南 昆明 650091)

产不同色素古尼拟青霉菌株功效成分分析*

贾学渊，郭 瑞，虞 泓**，陈自宏，曾文波，杨俊媛

(云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南 昆明 650091)

为比较产不同色素古尼拟青霉菌株菌丝体功效成分的差异，本研究对产不同色素古尼拟青霉菌株及对应古尼虫草样品进行试验分析。观察其菌落形态和菌落颜色；用紫外分光光度法测定多糖和D-甘露醇含量；用HPLC法测定虫草素、腺苷、肌苷、胸苷、鸟苷、尿苷6种核苷类成分含量。结果显示，菌落背面绿色的菌株pgjt03，腺苷含量是古尼虫草样品YHCGGB0145的6倍，且虫草素、胸苷、鸟苷、尿苷含量也均达到最高，与它对应的古尼虫草样品YHCGJT0148虫草素、腺苷、鸟苷、尿苷含量均高于其它古尼虫草；而菌落背面浅灰色的菌株pgjt01，核苷类成分含量均低于其他菌株。说明古尼拟青霉产色素与功效成分之间有一定的相关性，古尼拟青霉所产色素颜色越深，功效成分的含量相对越高。通过该研究指出，菌落颜色可作为筛选古尼拟青霉菌株高产功效成分的标志之一，且菌落背面绿色的菌株pgjt03，性状优良，生长较快，可作为潜在的生产菌株。

古尼虫草；古尼拟青霉；色素；功效成分

古尼虫草Cordycepsgunni(Berk.) Berk.，是1种虫草真菌寄生在蝙蝠蛾科幼虫中形成的复合体，主产澳大利亚、新西兰和我国的贵州、江西、湖南、安徽和广东等地。梁宗琦对中国的古尼虫草进行首次报道[1]，并通过组织分离和子囊孢子分离的方法鉴定出其无性型——古尼拟青霉PaecilomycesgunniiZ.Q. Liang[2]。研究发现，古尼虫草及其无性型古尼拟青霉含有多种生物活性物质，如多糖、甘露醇、核苷类物质、甾醇等[3]，具有提高免疫力[4]、促进睡眠[5]、镇痛镇静[6]、抗肿瘤[7]、抗衰老及心率失常[8]、提高记忆力[9]等多种药理活性。但由于古尼虫草目前还不能进行大规模人工栽培，只能依靠挖掘野生虫草，因此可以采用与其药理作用相近的菌丝体代替野生虫草入药。

本实验室从贵州和江西等地获得若干古尼虫草新鲜材料，通过菌种分离，发现分离出的4株古尼拟青霉菌株菌落形态差异较大，且菌落颜色明显不同。为探讨古尼拟青霉菌株产色素与功效成分的关系，本研究对所试菌株的菌落形态和菌落颜色进行观察，并测定和比较不同菌株菌丝体及对应古尼虫草多糖、D-甘露醇、腺苷、鸟苷、肌苷、尿苷、胸苷、虫草素的含量。试图探讨古尼拟青霉菌株产色素与功效成分之间的关系，为筛选高产功效成分古尼拟青霉菌株提供1种快速简便的方法。

1 实验材料与仪器

1.1 材料来源

本试验材料古尼虫草采自贵州省铜仁市和江西省宜春地区，根据形态、ITS及多基因分子系统分析[10，11]，鉴定为Cordycepsgunni(Berk.) Berk。本研究菌株分离自对应古尼虫草，根据形态、ITS及多基因分子系统分析，鉴定为PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang，为古尼虫草无性型。详见表1。

表1 本研究实验材料来源

1.2 培养基成分

菌种分离采用加1%蛋白胨PDA(PPDA)的固体培养基，液体培养基为马铃薯浸出汁20%、蛋白胨1%、蔗糖2%、KH2PO40.05%、MgSO40.1%。

1.3 仪器与试剂

戴安ULTIMATE 3000高效液相色谱仪；紫外分光光度计型号T6新世纪，购买自北京普析通用仪器有限公司；恒温震荡培养箱型号SCS-24，购买自上海市离心机械研究所；电热鼓风干燥箱型号DHG-9203A，购买自上海精宏实验设备有限公司。甘露醇、腺苷等标准品购于美国 Sigma公司，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 菌种分离

组织分离：将新鲜标本菌核部分仔细剥离出，用清水洗去尘土杂质，用75%酒精表面消毒。在无菌条件下，用刀切去虫体表皮，挑取虫体内部组织块于加1%蛋白胨PDA(PPDA)平板上，每皿放3块～5块组织块，25℃恒温培养。

2.2 菌落形态观察

将纯化的4株供试菌株用直径5 mm的自制打孔器打孔，然后将菌块接于PPDA固体培养基的培养皿中，25℃培养箱中培养，观察其菌落颜色、形态。

2.3 虫草多糖——苯酚-硫酸法

样品多糖含量测定：称取样品 0.2500 g，加蒸馏水30 mL，热回流2 h后趁热抽滤，用蒸馏水洗残渣，将滤液、洗液合并，定容至50 mL。量取定容好的溶液20 mL，置于挥发皿中挥干。将挥发后剩余物用1 mL蒸馏水溶解，置于10 mL离心管中，加入5 mL无水乙醇，混匀，置于离心机中 4 000 r·min-1离心15 min，弃上清液。沉淀物加蒸馏水、无水乙醇及离心，过程再重复2次，然后取沉淀物用蒸馏水溶解定容至50 mL作为样品液待用。吸取2 mL样品液至20 mL试管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混匀，快速加入7 mL浓硫酸，混匀，置于40℃水浴中30 min，再置于冰水浴中5 min，之后快速升至室温，用分光光度计测定490 nm波长吸光度。以蒸馏水代替待测样品溶液，用同样方法操作作为空白对照[12]。

2.4 D-甘露醇测定方法

样品中虫草酸(D-甘露醇)总含量测定[13]：称取样品 0.2500 g，加蒸馏水30 mL，热回流2 h后，趁热抽滤，用蒸馏水洗残渣，将滤液、洗液合并定容至50 mL。量取定容好的溶液1 mL，加入20 mL试管中，并加1 mL高碘酸钾(0.350 g高碘酸钾用0.12 mol·L-1盐酸定容至100 mL)溶液，混匀，室温放置10 min，加2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，混匀，加入4 mL新鲜配制的NaSh(7.500 g醋酸铵、100 μL冰醋酸、100 μL乙酰丙酮，定容至50 mL)试剂，53℃水浴加热15 min，之后快速冷却至室温，用分光光度计测定412 nm波长处吸光度。以蒸馏水代替待测样品溶液，用同样方法操作作为空白对照。

2.5 腺苷等核苷类成分采用HPLC法

色谱条件：戴安原装ACCLAIM pgjt018色谱柱，5 μm，4.6×250 mm；流动相V(甲醇)∶V(水)=15∶85；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；紫外检测波长260 nm。

样品处理：准确称取干燥至恒重的样品0.1 g置于5 mL离心管中，准确加20%甲醇2 mL，超声波振荡120 min，冷却至室温后，离心15 min，将上清液于0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液供HPLC分析，进样量10 μL[14]。

2.6 统计分析

采用SPSS软件中的Duncan’s新复极差法进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 古尼拟青霉菌株菌落颜色及菌落形态对比

不同菌株菌落形态及颜色的详细比较情况见表2。古尼拟青霉菌落形态及古尼虫草形态见图1。

表2 不同菌株菌落形态及菌落颜色对比

由图1、表2可见，4株古尼拟青霉菌株菌落颜色、菌落形态及对应古尼虫草形态明显不同。

3.2 不同菌株及对应古尼虫草功效成分分析

供试菌株液体发酵菌丝体及对应古尼虫草多糖、D-甘露醇含量经统计学分析后，结果见表3。

由表3可见，菌落背面浅灰色的菌株pggb01多糖含量最高，达12.74 mg·g-1，但与其他样品相比差异不显著；菌落背面绿色的菌株pgjt03多糖含量最低，与其他样品相比差异显著。古尼虫草样品D-甘露醇含量相对高于菌丝体，菌落背面黄色的菌株pgjt02，D-甘露醇含量最低。

表3 不同菌株及对应古尼虫草多糖、D-甘露醇含量分析

注：数字后所附字母为 Duncan’s 多重比较结果，字母相同表示无统计学差异，小写表示差异达到0.05显著水平。下同。

各样品核苷类成分的含量经统计学分析后见表4。

虫草素是虫草所特有的功效成分之一，由表4可见，菌落背面绿色的菌株pgjt03虫草素含量最高，达到109.55 μg·g-1，且与其他样品相比差异显著(p<0.05)，与它对应的古尼虫草样品YHCGJT0148，虫草素含量也高于其他古尼虫草；菌落背面浅灰色的菌株pggb01虫草素含量最低。菌落背面绿色的菌株pgjt03，腺苷含量最高达2 459.64 μg·g-1，且与其他样品相比差异显著(p<0.05)；菌落背面浅灰色的菌株pggb01腺苷含量最低。另外，菌落背面绿色的菌株pgjt03，胸苷、鸟苷、尿苷均达到最高，与其他样品相比差异显著(p<0.05),且与它对应的古尼虫草样品YHCGJT0148腺苷、鸟苷、尿苷也均高于其他古尼虫草。菌落背面浅灰色的菌株pggb01，胸苷、鸟苷、肌苷含量最低。

表4 不同菌株及对应古尼虫草核苷类成分分析

4 讨论

古尼拟青霉在镇痛、提高人体免疫力、抗紫外辐射、抗肿瘤、抗衰老等方面有明显的作用[15]。其中腺苷(Adenosine)和虫草素(Cordycepin)是古尼拟青霉重要的活性成分。腺苷具有抗病毒，抑制血小板积聚，防治脑血栓、脑溢血，消除面斑，抗衰防皱的作用[16]，虫草素具有抗菌、明显抑制肿瘤生长的作用[17，18]，且腺苷被中国药典(2005版)[19]规定为冬虫夏草的质控指标，因此研究保健食品中腺苷和虫草素的含量具有较高的实际应用价值。该研究中，菌落背面绿色的菌株pgjt03，腺苷和虫草素含量远远高于其他样品，其腺苷含量是古尼虫草样品YHCGGB0145的6倍。这就为实际应用中，筛选高产腺苷古尼拟青霉菌株奠定了一定的基础。

本研究还发现，古尼拟青霉菌株菌落颜色不同，其功效成分含量也不同。Shrestha Bhushan[20]对蛹虫草中产色素基因进行了研究，而本文对虫草真菌产色素与功效成分的关系进行了报道。菌落背面绿色的菌株pgjt03，虫草素、腺苷、胸苷、鸟苷、尿苷均达到最高，其对应古尼虫草样品YHCGJT0148，腺苷、鸟苷、尿苷含量也明显高于其它古尼虫草；而菌落背面浅灰色的菌株pggb01，核苷类成分含量均低于其他菌株。说明古尼拟青霉菌株产色素与功效成分之间有一定的相关性，古尼拟青霉菌株产色素颜色越深，功效成分含量相对越高，且菌丝体功效成分含量与古尼虫草样品也有一定的对应关系。

通过该研究暗示出，菌落颜色可作为筛选古尼拟青霉菌株高产功效成分的标志之一。且菌落背面绿色的菌株pgjt03，虫草素、腺苷、胸苷、鸟苷、尿苷含量均到达最高，其生长较快，可作为潜在的生产菌株。

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获得银耳菌种的3个方法

获得银耳菌种的方法主要有担孢子弹射分离法、组织分离法和耳木分离法。

1 孢子弹射法

这是利用新鲜的、成熟的子实体自动弹射出担孢子来获得纯菌种的方法。取朵大、色白、无病虫害的新鲜银耳作为种耳。用无菌水漂洗银耳数次，再用无菌纱布或吸水纸，把银耳表面的水分吸干。因为耳片表面若有薄水层，便会影响银耳担孢子的弹射，并容易污染上杂菌。再把种耳切一小块，以放入三角瓶或放入试管中不会碰到瓶壁或管壁为度，随后用不锈钢小钩钩住小耳片，迅速悬挂在三角瓶或试管内，同时注意勿使种耳碰到培养基表面，以防污染杂菌，塞上棉塞，然后放在20℃～25℃条件下，经过24 h，从耳片上弹射出来的担孢子，落在光滑的培养基表面上形成1个雾状的孢子印。此时，在无菌箱或无菌室中，将悬于瓶内的耳片取出，再塞上棉塞，移到20℃～25℃的室中培养，经过2 d～3 d，培养基表面就会出现许多乳白色、糊状的小菌落，此系银耳的酵母状分生孢子。当培养基上出现酵母状分生孢子的菌落时，为了防止和减少污染，应尽快地进行提纯，即挑取少许没有杂菌的银耳酵母状分生孢子，移入新的试管中进行培养。不管银耳担孢子或酵母状分生孢子都不容易萌发成菌丝，所以直接用于生产时有困难，目前已较少采用。不过，为了获得银耳有性繁殖的后代，必须采用担孢子分离法，并使之萌发成单核菌丝，然后进行配对实验。

2 组织分离法

和香菇、平菇不同，银耳组织分离法比较难操作，实用意义也不大。因为耳片一旦胶质化之后，就不容易再长出菌丝，况且段木种植的或野生的银耳，暴露在外界的生长时间很长，耳片上必定会附着各种杂菌，组织分离时既不容易把附着的杂菌洗掉，又不容易用药品进行表面的灭菌处理，且容易导致银耳和条菌同归于尽。只有位于树皮和木质部之间的肥厚的耳基比较容易进行组织分离，可以获得银耳的纯菌丝。不过用耳基分离来的银耳纯菌丝常是鹅黄色的或橙黄色的，不是纯白的，菌丝生长的速度也比较慢，效果也不太理想。

3 耳木分离法

利用长了银耳子实体的段木(简称耳木)来进行分离，是目前获得有实用价值的银耳菌种最主要的方法。耳木分离法的主要技术是排除耳木中杂菌的干扰，防止分离时污染杂菌，必须把银耳菌丝和香灰菌丝单独分离出来。对初学者来说，耳木分离法是不容易掌握的，必须反复练习，直到掌握分离的要领。

中国食用菌商务网

2014.05.02

Analysis of Effective Components in Different Pigment Strains ofPaecilomycesgunnii

JIA Xue-yuan, GUO Rui, YU Hong, CHEN Zi-hong, ZENG Wen-bo, YANG Jun-yuan

(Yunnan Herbal Laboratory, Institute of Herb Biotic Resources, Yunnan University, KunmingYunnan650091)

In order to compare the effective components with the different pigment strains ofPaecilomycesgunnii, the colonial morphologies and colors of different pigment strains were observed. The contents of cordycepic polysaccharide and D-mannitol were determined by ultraviolet spectroscopy. The cordycepin, adenosine, thymidine, vernine, inosine and uridine were determined by HPLC. The analytical results showed that the strain pgjt03 with colony green back side had the highest contents of cordycepin, thymidine, vernine and uridine in all of strains, it was 6 times than YHCGGB0145 in adenosine, and the counterpart sample YHCGJT0148 ofCordycepsgunniihad the higher contents of cordycepin, cordyceps adenosine, vernine and uridine than ones of the rest samples ofC.gunnii. Reversely, the strain pgjt01 with colony hoary back side had the lower contents of nucleosides than ones of the rest strains. It was illustrated that there were some relativities between the pigment strains ofP.gunniiand the effective components, and darker pigment strains ofP.gunniicontained higher the effective components. Through the study, it was implied that the colonial color of strains might be as a maker to select higher effective components ofP.gunnii, and the strain pgjt03 with colony green back side could be potential production strain, for having superior traits and fast growth.

Cordycepsgunnii;Paecilomycesgunnii; Pigment; Effective components

*项目来源：国家教育部博士点基金项目“冬虫夏草复合体种群DNA序列生态地理变异式样研究”(20125301110001)；云南省基础应用研究重点项目“云南虫草遗传资源及其开发利用研究”(2008CC019)。

贾学渊(1988-)，女，在读硕士研究生，主要从事虫草真菌系统学研究。E-mail:beckyjia@foxmail.com

**通信作者： 虞泓，教授。E-mail: hongyu@ynu.edu.cn 或herbfish@163.com

2014-03-15

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0041-04