兔颈总动脉破裂粥样硬化斑块模型炎症因子的表达

刘新叶+杨东伟++程勇+刘敏+池豪

[摘要] 目的 探索兔颈总动脉破裂粥样硬化斑块模型血清炎症因子的水平。 方法 将30只健康雄性新西兰白兔随机分为3组，对照组（n=10）、高脂饮食组（n=10）和球囊损伤组（n=10）。饲养8周后，采用“腔外负压”法诱导斑块破裂，观察兔血清脂蛋白、白介素-6及hs-CRP水平的变化，彩色多普勒超声鉴定斑块形成。 结果 高脂饲养8周后，球囊损伤组、高脂饮食组的血清脂蛋白水平、颈总动脉血流速度、IMT显著高于对照组（P＜0.05），而颈总动脉内径低于对照组；血清IL-6、hs-CRP水平显著高于对照组，高脂饮食组与球囊损伤组间差异有统计学意义。 结论 炎症反应参与动脉粥样硬化的形成，在粥样硬化斑块破裂中扮演重要角色；为破裂斑块的形成提供了一定的动物模型理论基础。

[关键词] 兔；动物模型；颈动脉粥样硬化斑块；炎症因子

[中图分类号] R743[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（b）-0004-04

The express of inflammatory factor in animal model of carotid atherosclerosis plaque rupture

LIU Xin-ye YANG Dong-wei▲ CHENG Yong LIU Min CHI Hao

Department of Cardiology,Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou 450007,China

[Abstract] Objective To explore the express of inflammatory factor in animal model of carotid atherosclerosis plaque rupture. Methods 30 healthy New Zealand white male rabbits were randomly divided into 3 groups including control group (n=10),carotid lesion group with balloon dilation (n=10) and the high fat-diet group (n=10).The concentrations of serum lipoprotein,interleukin-6,hypersensitive C reactive protein,internal diameter of carotids,intima-media thickness and blood flow rate of carotids were obtained used by color Doppler ultrasound respectively,plaque ruptures were triggered by negative pressures of intra-cavity in carotids injury group,the relationship among inflammatory factor,the severity of atherosclerosis and the achievement ratio of carotid atherosclerosis plaque rupture were evaluated. Results 8 weeks after the high-fat feeding,the concentrations of plasma lipoprotein,inflammatory factor,intima-media of carotids and blood flow rate of carotids were significant increase in high fatty combining with carotids injury group and diet group received alone compared with control group (P<0.05).Intima-media of carotids was not smooth and internal diameter was decreased than control group,there had significant difference between high fatty combining with carotids injury group and diet group received alone in inflammatory factor and internal diameter. Conclusion This study has shown inflammatory reaction not only conduce to the progression of atherosclerosis,but also play a important role in atherosclerosis plaque rupture,this study also provide more rationale of animal model in atherosclerosis plaque rupture.

[Key words] Rabbit;Animal model;Carotid atherosclerosis plaque;Inflammatory factor

动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应性疾病，常累及大中动脉，动脉粥样硬化斑块破裂与急性血栓形成可导致急性心肌梗死、猝死等[1]。越来越多的研究[2-3]显示，动脉粥样硬化斑块的形成是多种因素参与的慢性炎症过程，在动脉粥样硬化的发生、发展过程中，炎症反应发挥着重要的作用。既往可见动脉粥样硬化斑块模型与炎症因子相关性的研究，而关于破裂粥样硬化斑块模型与炎症因子水平的研究鲜见报道。本实验应用一种新的“腔外负压吸引”法诱发兔颈动脉粥样硬化斑块破裂，采用彩色多普勒超声进一步验证，观察实验前后血清脂蛋白水平以及炎症因子的变化，为进一步深入研究动脉粥样硬化的发病机制提供可靠的病理生理学基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性新西兰大白兔30只，体重2.0～2.5 kg，购自郑州大学动物实验中心。随机分为3组，对照组（n=10）、高脂饮食组（n=10）、球囊损伤组（n=10），均喂养8周。正常对照组饮食为普通颗粒基础饲料，高脂饮食为基础饲料+4%胆固醇+4%猪油，由郑州大学动物实验中心提供。

1.2 仪器与方法

1.2.1 血清脂蛋白水平的测定分别于手术前1 d和动物处死前1 d空腹状态下，抽取耳缘静脉血约5 ml，离心分离血清，应用日本Olympus AU640全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。采用酶联免疫吸附试剂盒测定白细胞介素-6（IL-6）的水平，ELISA检测高敏C反应蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）的浓度，严格按照试剂盒和酶标仪说明书步骤进行操作，至少测定3次，取平均值。

1.2.2 彩色多普勒超声检查应用美国惠普SONOS 5500彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为7.0～11.0 MHz。所有实验对象分别于手术前1 d和动物处死前1 d空腹状态下行彩色多普勒超声检查，测量兔左侧颈总动脉内径、颈动脉内-中膜厚度（intima-media thickness，IMT）及血流速度。将新西兰大白兔放置于检查台，头偏向检查对侧，充分暴露颈部，在胸锁乳突肌前或后缘作横切检查，超声探头沿动脉走行向头侧轻轻移动，跨过颈动脉分叉处，仔细观察血管内膜情况及有无斑块和钙化，所有操作由同一位超声科高年资医师完成。

1.2.3 动物模型的构建颈总动脉球囊损伤术：所有兔术前普通饮料适应性喂养3 d，术前禁食水6 h，腹腔注射氯胺酮（35 mg/kg），固定于手术台，常规消毒，静脉给予肝素钠约80 U/kg体重，沿颈部正中切开皮肤约5.0 cm，暴露并游离左侧颈总动脉，分离左侧颈内、外动脉，临时夹闭颈总动脉近心端及颈内动脉，颈外动脉远端结扎，距左颈总动脉分叉处约0.5 cm处剪开一个斜形切口，逆行插入直径约2.5 mm×10.0 mm球囊，连接压力泵，膨至3个大气压，由近心端缓慢回拉并旋转球囊，反复3次后撤出导管，结扎颈外动脉起始部，恢复颈总及颈内动脉血流，缝合皮肤（图1）。所有动物放置于同一动物房进行饲养。

1.2.4 颈动脉斑块破裂激发饲养8周后采用血栓抽吸装置对颈动脉斑块处进行腔外负压吸引，负压容量至于30 ml处、持续时间10 s负压吸引，激发斑块破裂，所有操作由同一实验人员完成（图2）。

图2 术中所用负压吸引装置

1.3 统计学处理

所得数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多组间比较采用ANOVA法，组间独立样本的比较采用方差分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组超声检测颈动脉内径、IMT、血流速度及激发斑块破裂数量的比较

饲养8周后，高脂饮食组、球囊损伤组较对照组颈动脉内径明显减少，IMT明显增加，血流速度明显增快；球囊损伤组与高脂饮食组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组无一例激发斑块破裂，高脂饮食组有1例激发斑块破裂，球囊损伤组有1例球囊损伤后死亡，有8例激发斑块破裂（表1）。

表1 各组超声检测颈动脉内径、IMT、血流速度及激发斑块破裂数量的比较

与对照组比较，*P<0.05；与高脂饮食组比较，#P<0.05

2.2 血清脂蛋白水平、IL-6及hs-CRP的变化

饲养8周后，高脂饮食组、球囊损伤组血清脂蛋白水平以及炎症因子水平明显高于对照组；球囊损伤组炎症标志物显著高于高脂饮食组，与激发斑块破裂的成功率显著相关（表2）。

3 讨论

动脉粥样硬化作为一种全身性疾病，主要累及体循环的大、中型动脉。目前认为，在血管内皮功能受损时，血脂成分进入血管内膜，导致炎症反应，引起脂质斑块的形成，胶原纤维、弹力纤维和平滑肌细胞增生，导致血管狭窄以及阻塞性病变。颈动脉粥样硬化与冠心病有着相似的病理生理基础[4]。颈动脉和冠状动脉在解剖结构上具有相同的特点及共同的生理基础和危险因素[5-6]。自Pignoli等[5]首次报导测量动脉IMT以来，IMT成为动脉粥样硬化研究中一个新的研究热点，有研究表明，在无心血管疾病患者中颈动脉IMT与心肌梗死和猝中风险呈正相关[7]，颈动脉IMT每增加0.1 mm，急性心肌梗死的危险性增加11%。炎症是诱发斑块破裂的主要原因之一，在不稳定斑块发生发展的过程中。很多炎症因子参与其中，例如CRP、基质金属蛋白酶（MMPs）、IL-6、细胞黏附分子等，这一过程为心血管疾病，特别是急性冠状动脉综合征早期的筛选、诊断、分类和预后提供了指导信息[8]。IL-6可由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）等分泌，并可作用于血管壁引起血管壁损伤，促进血管内皮细胞和VSMC增生，参与动脉粥样硬化的形成和发展，IL-6还可诱导肝脏产生急性期反应蛋白如CRP，促进血栓的形成；同时IL-6还可增强中性粒细胞和心肌细胞的黏附作用，促进中性粒细胞释放氧自由基，从而加重心肌细胞的损伤。hs-CRP是近年来报道的反映斑块炎症的生物标志物[9]，可以作为急性冠状动脉综合征的独立危险因素来检测[10-11]，是非S-T段抬高性急性冠状动脉综合征患者极早期血运重建术后近期及远期死亡的重要独立预报因子[12-13]。有研究证实[14]，在不稳定型心绞痛（UA）患者中，其敏感度较肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白（cTns）更高，对UA的早期治疗很有帮助。CRP有两种主要结合基团，能沉淀可溶性配体和颗粒性配体，一旦形成复合物则立即成为C1q开始的经典补体途径的强效激活物，释放炎症介质，促进细胞间黏附和吞噬细胞反应，溶解靶细胞；CRP也可作用于单核细胞和淋巴细胞表面受体，导致淋巴细胞活化和增生。既往研究表明，内皮损伤、基因转染、精神应激以及药物激发等方法可激发动脉粥样硬化斑块破裂，建立破裂粥样硬化斑块动物模型[15-16]，并观察到肿瘤坏死因子（TNF-α）、hs-CRP、白介素等炎症因子升高，但以上激发方法会引起全身性炎症反应，影响对实验动物真实状况的研究。本实验采用“腔外负压吸引”诱发斑块破裂，首先避免全身炎症反应的发生，也不造成内皮的直接损伤，可避免以上因素对炎症因子的影响。本研究结果显示，单纯高脂饮食组及球囊损伤组的IL-6及hs-CRP水平均较对照组显著升高，表明炎症反应参与动脉粥样硬化的进程；而斑块破裂组与单纯高脂饮食组炎症因子水平差异有统计学意义，显示高炎症反应更易导致斑块破裂，与既往研究结果一致[17]。

综上所述，炎症反应参与动脉粥样硬化的形成，在粥样硬化斑块破裂中扮演重要角色；为破裂斑块的形成提供了更接近真实病理状态的动物模型理论基础。

[参考文献]

[1]Spagnoli LG，Mauriello A，Sangiorgi G，et al.Extracranial thrombotically active carotid plaque as a risk factor for ischemic stroke[J].JAMA，2004，292（15）：1845-1852.

[2]Tobias P，Curtiss LK.Thematic review series：the immune system and atherogensis.Paying the price for pathogen protection：toll receptors in atherogenesis[J].J Lipid Res，2005， 46（3）：404-411.

[3]Lowe GD.The association between elevated levels of inflammation biomarkers and coronary artery disease and death[J].CMA J，2006，174（4）：479-480.