注射性坐骨神经损伤后针刺对家兔腓肠肌内NADH-TR和胶原纤维的影响

杨胜波，龙 胜，易晓东，于建奇

(遵义医学院 解剖学教研室，贵州 遵义 563099)

臀部外上象限肌内注射神经毒性药物如青霉素，安乃近，氯丙嗪，奎宁等意外引起坐骨神经损伤是一种可避免但又持续的全球性问题，尤其是发展中国家6岁以下儿童下肢肌萎缩而残疾的主要原因[1-4]。已有资料报道，失神经肌萎缩过程中，有的肌纤维型不稳定，可发生相互转换和选择性肌肉萎缩[5]，这与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶(NADH-TR)活性状态有关[6]。骨骼肌失神经后，胶原合成酶活性成倍上升，大量胶原纤维聚集可以阻止失神经肌肉神经再支配，造成失神经骨骼肌萎缩[7]。针灸是中国的传统医学，目前日益普及，作为西方世界的医学补充和替代的重要方式。针刺能明显改善骨骼肌萎缩，促进运动功能的恢复[8-9]。因此，本研究拟建立注射性坐骨神经损伤动物模型，导致下肢肌肉萎缩，然后针刺腧穴干预，观察针刺对小腿骨骼肌内NADH-TR和胶原纤维产生的影响，分析针刺效应的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年家兔42只，不拘雌雄，2.0±0.5kg，来自遵义医学院实验动物中心。根据注射性坐骨神经损伤后2周肉眼可见骨骼肌体积缩小，4周明显萎缩，以及肌萎缩的针灸治疗4周可见疗效[8，10]， 将动物分为7组：正常组6只；青霉素注射坐骨神经2周、4周组各6只；青霉素注射坐骨神经加针刺腧穴4周、8周组各6只，青霉素注射坐骨神经加针刺尾部4周、8周对照组各6只。

1.2 实验方法

1.2.1 注射性坐骨神经损伤动物模型的建立与穴位针刺治疗 2.5%戊巴比妥钠25 mg/kg耳缘静脉缓慢注射麻醉。股后区常规消毒，逐层切开，显露坐骨神经干，在神经干后面中线上进针，注射0.5 mL/20万U青霉素于神经外膜下[10]，逐层关闭切口，单笼饲养。注射青霉素4周，待下肢肌肉明显萎缩后，取后三里、三阴交和环跳穴配伍治疗[10-11]。33号毫针刺入穴位，捻转40～50次/min，留针30 min，1次/d，10 d为1疗程，间隔3 d，续下一疗程，治疗4、8周。对照组不取腧穴，仅随意针刺尾部组织。

1.2.2 大体观察与肌重测量 观察家兔步态后，空气栓塞处死。取下各组腓肠肌外侧头，观察肌块大小及色泽变化，称量肌重。

1.2.3 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶(NADH-TR)染色法和Van Gieson(VG)苦味酸酸性复红染色法 空气栓塞处死家兔，取下腓肠肌。因腓肠肌较大，有内、外侧头，本实验只检测损伤侧腓肠肌外侧头(右侧)，采用NADH-TR组化染色法和VG染色法，分别显示肌内NADH-TR和胶原纤维的变化。具体染色方法见我们之前的研究[6]。

1.2.4 肌纤维型构成比、平均光密度和肌纤维横切面积测量 NADH-TR染色后，在Leica图象分析仪下，每例测数10张切片，每张切片随机测数10个视野，每视野面积为500×500 μm2。

1.3 统计学处理 实验数据作t检验和单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大体观察和肌重变化 青霉素注射坐骨神经2周后，可见损伤侧下肢明显拖曳步态，4周时更严重，小腿外观变细，腓肠肌萎缩变小，无光泽。针刺腧穴治疗4周后，步态、肌块色泽与大小明显恢复，8周时进一步恢复。 针刺尾部对照组变化不大。正常家兔腓肠肌外侧头肌重为(2.74±0.39)g。青霉素注射坐骨神经损伤后2周，肌重降为1.82 g，4周时，继续下降至1.46 g，即下降了46.71%，针刺环跳、后三里和三阴交治疗4周，可见回升，8周时已恢复至正常的90. 29%。针刺尾部回升不明显，4 周 和8周时分别为1.84 g和1.85 g。各组各值之间的比较，P<0.01。

2.2 NADH-TR染色

2.2.1 染色所见 正常腓肠肌外侧头的横切片上，能明显区分出三型肌纤维。Ⅰ型纤维横切面积最小，着色最深，胞浆内蓝紫色颗粒细小，均匀分布；ⅡB型纤维横切面积最大，着色最浅，染色颗粒在胞浆周边要多于中央；ⅡA型纤维介于两者之间，染色中等，胞浆内染色颗粒粗大，在肌膜下分布多于中央。三型肌纤维镶嵌排列，可见同型纤维类聚现象(见图1A)。青霉素注射坐骨神经损伤2周后，切片颜色加深，纤维横切面不规整，边界开始模糊不清楚，染色颗粒不均匀，尚能分辨。Ⅰ型和Ⅱ型纤维的比例保持不变，ⅡA型纤维的比例增加，ⅡB型纤维相应减少，4周时进一步加重(见图1B，C)。针刺腧穴治疗4周后，ⅡA型纤维的比例下调，ⅡB型纤维相应增加，切片着色变浅；治疗8周，肌纤维横断面着色与比例进一步恢复，接近正常(见图1D，E)。针刺尾部4～8周，切片染色仍在加深，Ⅰ型和ⅡA型肌纤维界限更不清楚，分辨已困难(见图1F，G)。

2.2.2 肌纤维型构成比变化 各实验组腓肠肌外侧头内三型肌纤维的构成比(见表1)。青霉素注射坐骨神经损伤后2周，腓肠肌外侧头内Ⅰ型纤维含量变化不大，ⅡA型肌纤维百分比增加9.14%，4周时，增加了11.75%。ⅡB型肌纤维相应地减少。针刺腧穴治疗4周，ⅡA型纤维回落4.54%，8周时继续回落9.98%，ⅡB型肌纤维相应地增加，恢复接近正常。针刺尾部4～8周，ⅡA型肌纤维比例上升和ⅡB型纤维下降仍然渐进性加重。ⅡA和ⅡB型肌纤维的各组各值之间的q检验，P<0.05，有统计学意义。

注：其中图A的标尺为50μm，图B～G为200μm。图A显示正常腓肠肌外侧头内横切的三型肌纤维，即Ⅰ、ⅡA和ⅡB型纤维；图B和C分别显示青霉素注射坐骨神经损伤2周和4周；图D和E分别显示针刺腧穴4周和8周；图F和G分别显示针刺尾部对照4周和8周。图1 NADH-TR染色结果

2.2.3 三型肌纤维平均光密度值测定 各实验组腓肠肌外侧头内三型肌纤维的平均光密度值(见表2)。正常腓肠肌外侧头内三型肌纤维的平均光密度值分别是0.59±0.02、0.32±0.02、0.23±0.01。各实验组Ⅰ型和ⅡB型纤维的平均光密度值变化不大，其各值之间的比较，P>0.05，无统计学意义。青霉素注射坐骨神经损伤后2周，ⅡA型肌纤维光密度值增大，4周时增大了0.50倍，针刺腧穴治疗4周后，光密度值下降，治疗8周时，进一步下降，恢复了91.63%。针刺尾部4周，光密度值无下降，反而继续增大，8周时已为0.50±0.04，接近正常Ⅰ型纤维的平均光密度值。ⅡA型肌纤维光密度值各组之间的比较有统计学意义(P<0.01)。

2.2.4 三型肌纤维横切面积变化 各实验组腓肠

肌外侧头内三型肌纤维的横切面积(见表3)。青霉素注射坐骨神经后，三型肌纤维开始萎缩变细，2周时，其横切面积分别下降了22.36%、23.10%、24.06%；4周时，进一步下降了37.11%、38.36%、39.45%。针刺腧穴2周后，分别恢复了27.51%、27.88%、28.77%；4周时，已经回升至正常的94.65%、93.35%、94.52%。针刺尾部4～8周，可见肌纤维横切面积在神经损伤4周基础上渐进性缩小。各组各值之间的q检验，有统计学意义(P<0.01)。

2.3 VG染色所见 正常腓肠肌外侧头横切片内，在肌束与肌束间可见少许胶原纤维着为红色，肌纤维染为黄色，细胞核呈黑色(见图2A)。青霉素注射坐骨神经损伤后2周，胶原纤维已明显增生，4周时，胶原纤维更红，条索更粗(见图2B，C)；针刺治疗4周时胶原纤维有所减少；8周时明显减少，稍多于正常(见图2D，E)；针刺尾部4～8周,可见腓肠肌外侧头内胶原纤维比青霉素注射坐骨神经损伤4周时更多，网状的红色纤维穿越肌实质，满布视野(见图2F，G)。

组别腓肠肌外侧头Ⅰ型(%)ⅡA型(%)ⅡB型(%)正常组15．61±3．2215．61±3．2224．68±3．45注射青霉素2周15．66±2．2065．17±3．3619．17±3．44注射青霉素4周15．82±3．6766．73±2．9517．45±2．37注射青霉素加针刺腧穴4周15．69±3．3563．70±1．3720．16±3．35注射青霉素加针刺腧穴8周15．64±2．7360．07±4．2824．29±2．74注射青霉素加针刺尾部4周15．83±2．5667．03±1．8617．14±4．28注射青霉素加针刺尾部8周15．85±2．5869．31±1．2214．84±3．83

组别腓肠肌外侧头Ⅰ型ⅡA型ⅡB型正常组0．59±0．020．32±0．020．23±0．01注射青霉素2周0．60±0．030．38±0．030．24±0．03注射青霉素4周0．61±0．040．48±0．040．24±0．02注射青霉素加针刺腧穴4周0．60±0．020．41±0．010．23±0．04注射青霉素加针刺腧穴8周0．60±0．010．36±0．020．23±0．01注射青霉素加针刺尾部4周0．60±0．020．50±0．040．23±0．03注射青霉素加针刺尾部8周0．60±0．020．56±0．020．21±0．03

组别腓肠肌外侧头Ⅰ型(μm2)ⅡA型(μm2)ⅡB型(μm2)正常组578．23±21．46687．84±31．64761．56±34．53注射青霉素2周441．90±23．74528．95±27．67600．41±27．67注射青霉素4周342．31±36．93440．56±28．38473．08±39．85注射青霉素加针刺腧穴4周381．95±27．47478．01±32．85511．49±31．48注射青霉素加针刺腧穴8周515．20±31．53577．09±28．47647．71±25．73注射青霉素加针刺尾部4周332．02±23．68431．02±27．83458．51±26．53注射青霉素加针刺尾部8周319．58±31．89426．44±35．73450．66±25．74

注：其中图A～G的标尺均为200 μm。图A代表正常腓肠肌外侧头横切片，其内的蓝色箭头指向红色的胶原纤维；图B和C分别代表青霉素注射坐骨神经损伤2周和4周；图D和E分别代表针刺腧穴4周和8周；图F和G分别代表针刺尾部对照4周和8周。图2 VG染色示腓肠肌外侧头内各时间点胶原纤维的变化

3 讨论

注射性坐骨神经损伤可致以病人灾难性的打击，即小腿骨骼肌萎缩而致残。目前，骨骼肌萎缩的防治仍是全球的重大难题之一，但是，一种绿色的方法—针灸，能明显改善骨骼肌萎缩。神经损伤所致的肌萎缩属于传统医学的痿证之列，可施以足三里、三阴交，环跳等穴配伍，通过健脾益气、补肝滋肾、通经活络，促成肌肉筋脉得以滋养，从而改善肌肉萎缩[8-9,11]。

注射性神经损伤程度取决于药物本身毒性、注射位置、剂量多少等因素[1]。注射导致神经损伤的机理，普遍认为药物本身的毒性作用是导致神经水肿变性的主要因素，其次为神经内外瘢痕、微血管通透性的改变及针刺伤[12]。本实验在直视家兔坐骨神经条件下，将青霉素0.5 mL注射于坐骨神经外膜下，2周后，可见腓肠肌外侧头色泽变淡，肌重减轻，患侧后肢跛行拖曳，4周时更重，腓肠肌外侧头明显萎缩，达到了预期造模的目的。

无论是肌源性还是神经源性的肌肉疾病，其特征均为肌肉组织间隙胶原的过度积聚导致肌肉组织的纤维化而明显影响肌肉收缩功能[13]。失神经骨骼肌毛细血管密度降低速度大于肌纤维丧失速度，毛细血管供给主要影响肌纤维横切面积，毛细血管密度与NADH-TR阳性纤维成反比关系[5]。余茜等切断Wistar大鼠坐骨神经后,实施电针腧穴治疗，发现坐骨神经功能指数、运动神经传导速、肌肉动作电位、肌力恢复等明显优于对照组，提示针刺腧穴治疗能促进神经再生和肌肉功能恢复[14]。本研究中采用注射青霉素导致坐骨神经损伤，损伤后2周，也呈现ⅡA 纤维NADH TR染色加深，光密度值增大；横切片中见胶原纤维明显增生，肌纤维横切面积减小；4周时更重，肌肉明显萎缩。针刺足三里、三阴交、环跳治疗4周后，ⅡA 纤维NADH TR染色着色逆转，光密度值回降；胶原纤维减少，肌纤维横切面积回升，肌重增加，肌块色泽与萎缩以及拖曳好转，治疗8周时进一步好转，肌萎缩明显改善，而针刺尾部对照无好转甚至加重，各组间的比较有统计学意义(见图1，2和表1～3)。我们认为，注射具有神经毒性的青霉素后，坐骨神经发生水肿变性，肌肉失去了神经的直接营养作用，支配骨骼肌的交感神经舒张血管的节后纤维受损，加上肌肉毛细血管迅速退化，胶原纤维数随神经受损时间延长而明显增多，肌纤维被越来越多的胶原纤维阻隔，肌肉供血则不足，导致肌重减轻及肌萎缩。针刺腧穴治疗后，胶原纤维减少,肌内毛细血管逐渐穿越胶原阻隔，肌内营养供给增加，肌萎缩得到改善。

骨骼肌纤维根据生理需求的变化调整自己的形态、生化和功能特性，肌纤维型可发生相互转换：ⅡB型↔ⅡX型↔ⅡA型↔Ⅰ型[8]。我们的实验结果(见图1和表1～2)显示：青霉素注射坐骨神经2周时，腓肠肌外侧头内ⅡA型纤维NADH-TR染色加深，光密度值增大，4周时更重。提示线粒体和肌浆网内NADH-TR从休止状态转为了激活状态[6]，IIA型纤维比例增加，IIB型纤维相对减少, ⅡB型→ⅡA型，肌内发生了选择性纤维萎缩，即ⅡA型与ⅡB型萎缩相对较重。针刺穴位治疗4～8周后，肌纤维型发生了转换，即IIA型纤维百分比回落，IIB型纤维相应回升(ⅡA型→ⅡB型)。但是，I型和II型纤维的比例始终保持不变，这些结果提示针刺腧穴能降低肌内NADH-TR活性，导致肌纤维型发生逆转，满足肌纤维的生理需求，进而改善了肌肉萎缩；腓肠肌外侧头内I型纤维比较稳定,在防治肌肉萎缩中有望成为重要靶标。

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