分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌的构建

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032)

水蛭素是一种由65～66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约为7 KDa，是迄今发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂[1].天然水蛭素有十几种变异体，其中研究最多且具有较好抗凝血酶活性的是HV1，HV2，HV3.由于三种水蛭素的提取部位不同使它们的活性存在差异，从口部提取的HV2活性最高，从头部提取的HVl活性次之，从身体其他部位提取的HV3活性最低.由于天然医用水蛭具有很好的开发价值，但在自然界中天然水蛭的来源十分有限，且提取成本高、效率低下，不利于大规模生产.因而，随着分子生物学的发展，国内外医药界均着重研究通过基因工程的技术制备重组水蛭素[2].

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、生长繁殖快速、生产成本低廉等优点，是目前应用和研究最广泛的蛋白表达系统.然而，由于外源蛋白在大肠杆菌中多以包涵体的形式表达，需要通过变性、复性等复杂步骤才可以恢复部分活性.在目的基因前面插入一段信号肽基因，可以利用信号肽引导外源蛋白到细胞周质空间分泌表达.不仅能使目标蛋白以活性结构生成，并且信号肽在分泌过程中可以自行切除，无需破菌，直接进行周质蛋白提取就能得到较高纯度的目标蛋白，从而简化了后续的分离纯化步骤[3-4].基于信号肽酶在切割信号肽的过程中与切割位点的氨基酸分子量有密切的联系，本研究通过基因设计和重叠延伸(SOE)技术，将一种水蛭素的N端第一个氨基酸进行突变，经克隆、表达后，成功构建突变型和天然型的两种分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌.两种重组水蛭素Ⅱ经周质蛋白提取和阴离子交换层析，通过电泳检测和活性测定，比活性相同，突变型的表达量更高.

1 材 料

1.1 菌株与质粒

pET-39b(+)购自Novagen公司；E.coliDH5α，BL21(DE3)为本实验室保存.

1.2 引物和酶类

引物合成和测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；T4 DNA 连接酶、限制性内切酶NdeI、BamH I购自Fermantas，pfuDNA聚合酶购自Sangon.

1.3 试 剂

B型小量质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物科技有限公司；3S DNA Gel Purification Kit购自北京庄盟生物科技有限公司；100 bp Loading DNA Marker和Protein Molecular Low Marker购自Sangon；凝血酶和纤维蛋白原购自上海源叶生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯.

2 方法与结果

2.1 目的基因的获得

按照DsbA信号肽基因序列以及HV2基因序列，用引物设计软件DNASIS设计了以下6个片断：

A: 5’GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGC 3’

B1: 5’ACCCGACTCGGTGCAATCGGTGTAGGTAATCGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACT 3’

B2: 5’ACCCGACTCGGTGCAATCGGTGTAGGTCGCCGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACT 3’

S-1: 5’GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTG 3’

H-1: 5’ATTACCTACACCGATTGCACC 3’

H-2: 5’TTTGGATCCTCATTGCAGGTACTCT 3’

其中：B1(B2)的5’端与HV2正义链5’端的30个碱基反向互补，在B2链中将HV2正义链5’端的前3个碱基进行了突变；A片段的3’端与B1(B2)片段的3’端有18个碱基互补配对；S-1为A片段5’端的前24个碱基；H-1和H-2片段用于扩增HV2序列.

首先在pfuDNA聚合酶的作用下，以A片段和B1(B2)片段的18个碱基反向互补配对，一步退火，延伸合成DsbA信号肽AB1(AB2)链.然后以化学合成的HV2全基因序列为模板，H-1和H-2为上下游引物PCR扩增HV2片段.PCR参数：94 ℃预变性3 min，进入循环：94 ℃变性30 s，41 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，2个循环；再94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，26个循环；最后72 ℃延伸10 min.

最后通过SOE-PCR法[5-6]分别将AB1(AB2)链和HV2序列拼接.以S-1和H-2为上下游引物，PCR扩增全序列spHV2和spHV2mut，PCR条件参数：94 ℃预变性3 min，进入循环：94 ℃变性30 s，41 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，2个循环；再94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，26个循环；最后72 ℃延伸10 min.全过程如图1所示.

图1 获得全长目的基因的方法

2.2 工程菌的构建

将2.1所得到的PCR产物和pET-39b(+)质粒分别用NdeⅠ和BamHⅠ在37 ℃消化2 h，经琼脂糖凝胶电泳和3S DNA Gel Purification Kit纯化回收，回收产物用T4 DNA ligase在4 ℃冰箱中连接过夜后，用CaCl2法转化克隆宿主E.coliDH5α.挑选能在卡那霉素抗性LB固体培养基上生长的单克隆，以T71测序引物、H-2作为正反向引物，菌落PCR筛选出阳性克隆子，送金斯瑞生物科技有限公司测序.将经测序证实的阳性重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，得到两种基因工程菌.

2.3 重组水蛭素Ⅱ的初步纯化

采用“冷休克”法从细胞周质空间中提取两种目标蛋白[7]，具体流程：挑取2.2中经筛选后的阳性克隆接种于3 mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB培养中，37 ℃培养过夜，次日按1%接种量转接于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃培养至OD600为0.3～0.5时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG[8]，28 ℃诱导培养4 h.取适量发酵液于4 000 r/min离心15 min，收集菌体，用含20%蔗糖的20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，重悬菌体，冰浴30 min；加4倍体积蒸馏水，冰浴30 min；4 000 r/min离心10 min，收集上清.

将上述收集的上清溶液，以2 mL/min的速度上样于经10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)平衡过的Q-Sephorase FF柱中，用50 mL含10 mmol/L的NaCl溶液进行预洗脱；接着用50 mL含40 mmol/L 的NaCl溶液进行洗脱，得到两种目标蛋白[9-10].经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析[11]，初步确定纯化效率.

2.4 重组水蛭素Ⅱ的抗凝血活性测定

按Markwardt凝血酶滴定法[12]对两种蛋白的活性进行测定.取1支小试管加入0.5%纤维蛋白原溶液200 μL，再加50 μL上述2.3中的两种样品，混匀，滴加100 NIH/mL凝血酶5 μL摇匀，37 ℃恒温水浴下1 min不凝，再滴加相同浓度凝血酶5 μL，直到纤维蛋白原溶液在1 min内凝结，所用凝血酶总量，再乘以20即可计算出样品每毫升活性.

2.5 PCR和SOE产物结果

以HV2全合成基因序列为模板，H-1和H-2分别为上下游引物，用pfuDNA聚合酶经PCR扩增后，得到HV2片段；A片段和B1(B2)片段在pfuDNA聚合酶作用下合成AB1(AB2)链；最后，以S-1和H-2分别为上下游引物，用pfuDNA聚合酶经SOE-PCR，将AB1(AB2)链和HV2基因序列拼接，得到两个基因片段spHV2和spHV2mut，经2.5%琼脂糖凝胶电泳分析，可见大小分别为200，100，270 bp左右的特异性扩增条带，与理论大小相符，结果见图2.

1，3，6-DNA Marker；2-HV2基因；4，5-AB1片段，AB2片段；7，8-两种目的产物

基因片段spHV2和spHV2mut分别经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后，重组于载体pET-39b(+).转化E.coliDH5α，用T71测序引物和H-2分别作为正反向引物经菌落PCR，扩增得到与目的基因大小略大的PCR片段，初步说明两个目的基因已经分别插入pET-39b(+)中.经测序证实，确定pET39-spHV2和pET39-spHV2mut构建成功.质粒图谱见图3.

图3 重组表达载体pET39-SHV2图谱

2.6 重组水蛭素Ⅱ的初步纯化结果

工程菌经IPTG诱导表达后，用“冷休克”法从细胞周质空间中提取目标蛋白，经Q-Sephorase FF柱纯化后得到纯度较高的目标蛋白HV2和HV2mut.再经上样—预洗—洗脱后，各个部分经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果见图4，5.

M-protein marker；1，2，3—100 mmol/L NaCl 洗脱；4—40 mmol/L NaCl 洗脱；5—10 mmol/L NaCl 洗脱；6—穿透液； 7—周质提取液

M-protein marker；1，2-100 mmol/L NaCl 洗脱；3-40 mmol/L NaCl洗脱；4-10 mmol/L NaCl洗脱；5-穿透液；6-周质提取液

2.7 重组水蛭素Ⅱ的活性测定结果

采用Markwardt凝血酶滴定法测定重组水蛭素HV2和HV2mut,结果显示：HV2活性为500 ATU/mL，HV2mut活性为900 ATU/mL，两者比活性相同，因此突变型的表达量约为天然型的2倍.

3 结 论

水蛭素作为一种凝血酶有效而特异的抑制剂，在动物模型实验及临床研究中能够有效地预防动、静脉血栓的形成及弥散性血管内凝血，是一种很好的溶栓药物辅助剂.随着分子生物学技术的发展，重组水蛭素的制备已成为热点.在大肠杆菌周质空间的分泌表达不仅有利于表达蛋白的纯化，更重要的是蛋白在分泌过程中能正确折叠，从而获得有活性的目标蛋白.信号肽可以引导外源蛋白从胞内向周质空间分泌，在分泌过程中信号肽酶的切割位点多为小分子氨基酸.基于在质粒载体pET-39b(+)中，DsbA信号肽酶在切割时的天然识别位点为Ala-Ala，为了提高DsbA信号肽酶的切割效率，增加目标蛋白的周质空间表达量.本研究采用SOE技术将水蛭素Ⅱ的N端第一个氨基酸Ile的基因序列突变为Ala的基因序列，并将突变和未突变的水蛭素Ⅱ基因与DsbA信号肽基因融合，实现两种水蛭素Ⅱ在大肠杆菌周质空间的分泌表达.通过电泳检测和活性测定，与天然型水蛭素Ⅱ相比，突变型的周质空间表达量提高了近一倍.本研究制备了两种分泌型水蛭素工程菌，简化了后续的分离纯化步骤，有望在进一步完善后进行产业化，为临床应用和基础研究提供大量的重组蛋白.

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