用于多药耐药转运评价的P糖蛋白底物罗丹明123定量方法的建立*

★ 李秀琼 袁慕荣 孙亚彬 刘思佳

(1.佛山市中医院药剂科 广东 佛山 528000；2.南方医科大学南方医院药物临床试验机构 广东 广州 510515；3.南方医科大学南方医院药学部 广东 广州 510515)

罗丹明123(R123)又称双6-氨基3-亚胺基3H-氧杂蒽-9-yl苯甲酸甲酯，其分子式为C21H16N2O3·HCl，相对分子质量为344.4。它是一种发黄绿色荧光的荧光染料，可以根据细胞膜的选择性来染色活细胞线粒体,广泛用作检测线粒体膜电位，也常用于细胞凋亡检测。另外，R123可以快速通过细胞膜,高度选择性地聚集在线粒体,并且对细胞没有任何毒性，同时被多药耐药细胞(mμLtidrug resistance ,MDR)有效排出[1-5]。R123是P糖蛋白的一种底物，常用于癌症研究[4,5]。现在常用检测R123的方法有：荧光分光光度计[6-8]，高效液相荧光检测器[9,10]，酶标仪[11]等。

R123作为多药耐药性体内评价的指示剂时,通常需要检测其在血液中的浓度。但是现在还未发现有文章应用LC-MS/MS系统的评价R123在血浆中的检测方法学，并且考察其提取方法，精密度，灵敏度等。本文建立了用LC-MS/MS检测血浆中R123浓度的方法学，并保证了分析方法快速，灵敏度高，高选择性。

1 材料与方法

1.1 试剂 罗丹明123(批号：046K3688)；内标罗丹明6G(批号：1425911V)；甲醇，乙腈均为分析纯，购自西格玛公司(中国上海)。乙酸乙酯，二氯甲烷，碳酸氢钠均为色谱纯，购自CAF公司(中国广州)。

1.2 装置 Agilent 1100 Series液相色谱仪；Agilent 6410三重四极杆液相色谱/质谱；Agilent MassHunter色谱管理系统。

1.3 LC-ESI-MS 用Zorbax Eclipse XDB C18column(150mm×3.5mm，5μm；Agilent, Wilmington, DE, USA)在柱温为40℃时分离血浆中的待测物。流动相为甲酸铵(包含5mM甲酸铵及1%的甲酸)和乙腈(5∶95)，流速为0.5mL/min。自动进样器的温度设定为25℃

质谱应用阳离子多重反应器(MRM)。离子喷雾电压为+3.5kV，发热气体温度为350℃，干燥气体流速为10L/min。MRM用于数据采集。R123 MRM优化后，离子碎片跃迁m/z 345～285，碰撞能量为44eV。R6G离子碎片跃迁m/z 443～415碰撞能量为41eV。每次跃迁时间为200ms。

1.4 制备标准品及质控(QC)样品。 精密称取R123 1mg溶解于甲醇中，制成浓度为1mg/mL的储备液。将储备液用甲醇连续稀释制成工作液浓度：1，2,10,50,100,150,200ng/mL。QC用储备液用同样的方法单独稀释，浓度分别为2,100,150ng/mL。内标用甲醇配成浓度为1mg/mL的储备液，并稀释成50ng/mL。所有溶液均保存于4℃环境中，使用前在室温中放置。

1.5 血浆样品的提取 将100μL内标(50ng/mL，用甲醇稀释)蒸干后加入0.1mL血浆样品中，然后加入0.1mL饱和碳酸氢钠，混匀，再加3mL乙酸乙酯/二氯甲烷(4∶1)，混合后斡旋1min，之后3500转离心10min。上清液转移至干净的玻璃试管中，用真空干燥箱挥干。残渣用200μL流动相复溶，取2μL用于LC-MS/MS分析。

1.6 方法学验证

1.6.1 选择性 比较R123及内标分别在空白血浆及空白血浆中添加最低检出限浓度的R123及浓度为50ng/mL的R6G及体内含药血浆中的MRM色谱图，验证样品的色谱峰没有受内源性物质干扰。

1.6.2 标准曲线及最低检出限(LLOQ) 血浆配置3组标曲工作液，用于拟合标曲。分析物及内标的比值使线性最小加权平方满足条件后，3组工作液拟合出合适的标曲，并且确定最低检测限

1.6.3 回收率 检测2,100,150ng/mL三个浓度的R123的血浆中提取回收率。血浆样品中均加入等量一定浓度的内标。比较提取血浆后待测样品的浓度与相对应的原始浓度的比值即为提取回收率。

1.6.4 精密度与准确度 将QC样品配成三个浓度，并且每个浓度设置15个复孔，验证此方法学的日间及日内的精密度及准确度。精密度的结果用RSD。准确度用RE%表示。

1.6.5 稳定性 考察含有R123的血液样本的室温稳定性，样本的处理液稳定性，以及反复冻融稳定性。室温稳定性：室温条件下放置1 h和24 h后，处理样本，与新鲜配制的储备液比较；样本的处理液稳定性：样本处理后，1 h和24 h后进样分析，与新鲜配制的储备液比较；反复冻融稳定性：冻融1和3次后，处理进样分析，与新鲜配制的储备液比较。当贮备液浓度范围与初始浓度相比在85%与115%之间时，被认为是稳定性良好的。冻融稳定性温度为-20℃～25℃反复循环。

1.6.6 介质效应 根据Matuszewski[12]的方法，进行介质效应考察。由于实验中相关介质物质被洗脱出，可能造成介质效应或者潜在的离子效应抑制或者增强。将空白血浆样品按相同条件提取后，加入已知浓度，与QC样品的浓度相比。内标的介质效应按相同方法在50ng/mL浓度时进行考察。

2 结果

2.1 色谱条件优化 R123在Q1全扫描模式下，(M+H)离子具有较高的液质响应值，并且没有观察到其他的离子出现。子离子扫描时，当CE值为44eV时，R123最大离子碎片为m/z=285。R6G作为R123的结构类似物被用于做内标。R6G在全扫描模式下，母离子跃迁m/z=443。多离子反应监测下，子离子碎片在m/z=415时是稳定的。R123及R6G的质谱图见图1，2。

分别考察甲醇与乙腈的流动相PH，缓冲液，组分对保留时间及分离度的影响，发现甲醇对背景的干扰力大于乙腈。选择甲酸铵(包含5mM甲酸铵及1%的甲酸)和乙腈(20∶80)做为流动相，R123与内标R6G的保留时间分别为2.807，3.15 min。

用乙酸乙酯，甲醇，二氯甲烷(单独以及联合用)做为提取溶剂时，提取回收率很低(小于45%或不相容)。当选择乙酸乙酯做为提取剂使，提取率明显增高。实验最终选取乙酸乙酯∶二氯甲烷(4∶1)以及加入饱和碳酸氢钠，与其他提取剂相比，提取效率最高，并且没有发现杂峰。

图1 R123全离子扫描图谱

图2 R6G子离子扫描图谱

2.2 方法学验证

2.2.1 方法选择性 从血浆中提取出的R123及R6G的3种典型MRM色谱图如图3所示。药物及内标的色谱图在各自的保留时间内均没有内源性基质的干扰。

A.空白血浆；B.空白血浆中添加最低检出限浓度的R123及浓度为50ng/mL的R6G；C.尾静脉注射R123 360min后测得的血浆中R123的MRM色谱图

2.2.2 线性及LLOQ 标准曲线为：Y=1.1575X+0.0027，r=0.9999(n=7)，1ng/mL为最低检测限。

2.2.3 回收率 R123在三个质控浓度检测下的提取回收率为87.73%，92.16%及91.23%。而内标的回收率为78.13%。R123及内标的回收率前后一致性良好并且没有浓度依赖性。

2.2.4 精密度及准确度 表一中总结了所有的相关值。日内精密度分别为6.95%，3.33%，1.41%，日间精密度分别为：9.2%，3.02%，2.09%。准确度范围为-3.03%～5.26%。

表1 大鼠血浆R123准确度及精密度

相对误差(%)=[(平均浓度-理论浓度)/理论浓度]×100。2.2.5 稳定性 表2总结了R123的样品的稳定性，并且没发现显著性的分解。数据表明R123是可以在实验条件下反复保存和提取的。

表2 大鼠血浆中R123的稳定性测定(ng/mL,±s,n=15)

2.2.6 介质效应 R123三个浓度的介质效应分别为：99.89%，99.26%和101.73%。内标的介质效应为101.88%。

3 结论

本文应用LC-MS/MS方法检测人血浆中R123的浓度。方法的最低检测限为1ng/mL，浓度范围为1～200 ng/mL。LC-MS/MS是用于检测血浆中R123含量的快速且灵敏的方法。

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