乌梅丸对小鼠乳腺癌增殖转移及Fas、FasL分子表达的影响*

★ 王萍 杨海燕 施旻

(江西中医药大学 江西 南昌 330004)

在不能彻底治愈大多数恶性肿瘤的背景下，抑制恶性肿瘤的转移是防治肿瘤的关键因素。中医药在扶正祛邪的原则指导下，对改善肿瘤患者生存质量和延长生存期等方面具有一定的优势[1]。目前中医对恶性肿瘤转移的病因病机认识还不是很完善，我们在此基础上提出了厥阴风动的病机是恶性肿瘤转移的可能机制，以此解释恶性肿瘤的病因——“痰”、“瘀”“毒”等流窜至其他部位的过程。而乌梅丸作为厥阴病的主方，以乌梅为君药，具有收敛肝风的作用，全方兼有清热燥湿解毒、益气温阳等作用[2]。本研究以小鼠乳腺癌转移模型为对象，观察乌梅丸对肿瘤转移的影响，探讨厥阴风动病机在肿瘤转移中的作用。

1 材料和方法

1.1 动物 SPF级BALB/c小鼠，20±2g，雌性，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。

1.2 药物与试剂 乌梅丸方(乌梅20g、细辛3g、干姜6g、桂枝6g、淡附片6g、蜀椒4g、黄连3g、党参10g、当归10g、黄柏6g)各组成药物采用配方颗粒剂，由广东一方制药有限公司生产。临用前按说明将颗粒剂倒入容器中，加开水溶解，冷却后备用，制成1g/mL生药浓度药液。

FAS antibody、FAS-L antibody、两步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 细胞株 小鼠乳腺癌4T1细胞株由江西中医药大学教育部重点实验室刘波老师惠赠，购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。

1.4 方法

1.4.1 乳腺癌细胞培养与接种造模 乳腺癌4T1细胞经常规培养后，收集生长状态良好的细胞，以无血清RPMI1640培养液调整为1×107个/mL浓度细胞悬液。于BALB/c小鼠第4对乳腺右侧乳垫下接种细胞液0.1mL。1周后观察接种处肿瘤生长情况，增殖为绿豆大小的肿瘤即造模成功。

1.4.2 动物分组与用药 选择肿瘤大小一致的小鼠随机分为4组，其中药物组3组，模型对照组1组。药物组分别为乌梅丸全方组(简称乌梅丸组)、乌梅丸去乌梅组(简称去乌梅组)及乌梅单味药组(简称乌梅组)。根据小鼠体重，以人临床用药折算量进行药物干预1个月。

1.4.3 一般情况观察 每天观察各组小鼠的取食情况、精神状态、毛发整齐与光泽度及死亡情况。

1.4.4 肿瘤生长曲线 每隔4天用游标卡尺测量乳腺癌接种处肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，瘤体积=0.5×长径×短径×短径。取各组平均体积，绘制生长曲线。

1.4.5 抑瘤率 药物干预结束后称量小鼠体重，并剥离接种处肿瘤，称取瘤重。抑瘤率IR(%)=(1-药物组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

1.4.6 肿瘤转移观察 剥离接种处肿瘤后，肉眼探查其他部位可见肿瘤情况。暴露胸腔，完整分离肺脏后，置于Bouin's液中固定24h，无水乙醇脱色，观察肺部转移灶情况。

1.4.7 瘤组织Fas与FasL分子的表达 剥离后的肿瘤块立即置于4%中性甲醛中固定24h，经常规程序制作成石蜡组织切片。采用两步法免疫组化方法观察瘤组织Fas和FasL分子的表达情况，用图像分析仪进行图像采集。

1.4.8 统计学方法 采用IBM SPSS 19.0分析软件，多组均数比较采用应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)的LSD检验进行统计处理。

2 结果

2.1 一般情况 荷瘤小鼠至20天左右，乌梅丸组各小鼠活动状态好，毛发整齐有光泽，其余三组活动状态欠佳，毛发乱而少光泽。至26天后去乌梅组、模型对照组各死亡1只，至28天乌梅组死亡1只。

2.2 肿瘤生长曲线 各组乳腺癌接种原位瘤的体积如表1、图1所示：肿瘤的增殖趋势在各组间一致，随着时间的推移，肿瘤体积不断的增长；实验最后一次测量时间点表明，各药物组的平均瘤体积较模型对照组小，但只有乌梅组与模型对照组比较有统计学差异(P=0.041)；药物各组间肿瘤体积差异不明显。

表1 乳腺癌接种原位瘤平均体积(mm3)

图1 乳腺癌接种原位瘤生长曲线

2.3 抑瘤率 各组的接种原位瘤经剥离后称重，如表2所示：各药物组的平均瘤重均比模型对照组轻，但只有乌梅组与模型对照组比较有统计学差异(P=0.019)；各药物组间，乌梅组较去乌梅组瘤体积更小，有统计学差异(P=0.048)。乌梅组、乌梅丸组、去乌梅组的抑瘤率呈下降趋势。

表2 各组的瘤重及抑瘤率情况

2.4 肿瘤转移情况 如表3结果所示：乌梅丸组除有1例出现胸腔积血外，其余胸腔部清晰，肺部无明显肉眼可见转移瘤；去乌梅组有3例出现胸腔积血，肺部不清，有肉眼明显可见转移瘤，有1例出现腹部皮下绿豆大转移瘤，1例出现颈部2处黄豆大转移瘤灶；乌梅组有2例出现胸腔积血，肺部不清，有肉眼明显可见转移瘤，有1例出现右上肢腋下5mm×5mm肿瘤灶，1例出现膈肌转移灶；模型对照组有3例出现胸腔积血，肺部不清，有肉眼明显可见转移瘤，1例出现肋间转移灶。

Bouin's液固定肺部后，计算肺表面转移灶数，结果如表3和图2，各药物组的转移灶数均较模型对照组少，其中乌梅丸组与模型对照组比较有统计学差异。

表3 各组乳腺癌转移情况

1-乌梅丸组；2-去乌梅组；3-乌梅组；4-模型对照组

2.5 瘤组织Fas与FasL分子的表达 如图3、图4所示，乳腺癌细胞胞浆中的棕黄色颗粒即为Fas或FasL分子。乌梅丸组、去乌梅组和乌梅组的Fas表达均较模型对照组多；而FasL分子则是模型对照组表达更明显。

A-乌梅丸组；B-去乌梅组；C-乌梅组；D-模型对照组

3 讨论

乌梅丸是厥阴病的主方，主要用于蛔厥证，具有温脏安蛔虫、寒热并用、邪正兼顾的功效。后世医家根据乌梅丸组方不断扩大其应用范围[3]，其中乌梅丸也应用于恶性肿瘤相关病证的治疗[4,5]。本研究依据厥阴风动病机可能与恶性肿瘤的转移相关的假设，探讨了乌梅丸对小鼠乳腺癌生长和转移的影响，并通过拆方研究同步探究了乌梅丸中酸敛熄风的主药乌梅的作用。研究结果表明，乌梅丸及各拆方组均可以一定程度抑制小鼠乳腺癌的增殖和转移。

Fas与FasL是肿瘤细胞免疫中的重要分子。杀伤性淋巴细胞表达的FasL分子与肿瘤细胞表面的Fas分子结合，可以诱导肿瘤细胞的凋亡。但恶性肿瘤发展过程中，肿瘤细胞常改变自身的分子表达情况，从而逃避免疫细胞的识别杀伤，即肿瘤的免疫逃逸机制。其中恶性肿瘤细胞常调低自身Fas分子的表达而避免淋巴细胞的杀伤，另外也可以高表达FasL分子与高表达Fas分子的淋巴细胞结合导致后者的凋亡。这些免疫逃逸机制促使了恶性肿瘤细胞的存活，有利于其增殖转移[6]。本研究结果也初步显示了乌梅丸各组可以上调乳腺癌细胞Fas分子的表达，下调FasL分子的表达。这些机制可能与乌梅丸各组抑制乳腺癌的增殖和转移有关。

但拆方研究结果还没有明显的证据表明乌梅在全方抑制乳腺癌增殖和转移中的作用。乌梅丸中包含有扶正的附子、党参、当归等药物，也包含祛邪的黄连、黄柏等药物，全方的抑制肿瘤的作用是否与这些药物相关还得进行深入的探讨。

[1]王锦鸿.中医在治疗恶性肿瘤中的作用与地位[J].江苏中医,2001,22(11):1-3.

[2]刘英锋,姚荷生.从寒温理论沟通看厥阴主风病机与乌梅类方活用之理论探讨[J].中华中医药杂志,2013,28(1):27-31.

[3]刘芳,谢鸣,朱丽瑶.乌梅丸现代主治病证的研究[J].北京中医药大学学报(中医临床版),2011,18(4):37-40.

[4]黄金昶,徐林.加味乌梅丸治疗胰腺癌21例疗效观察[J].中国临床医生,2012,40(11):52-55.

[5]田卫中,胡旭陇.乌梅丸治疗宫颈癌放疗后引起的泄泻[J].医学理论与实践,2004,17(1):63-64.

[6]孙麟,陈乔尔.Fas/FasL凋亡系统与肿瘤免疫逃逸研究进展[J].医学综述,2008,14(6):833-835.