水蛭提取物对HL-60细胞增殖与分化的影响

★ 肖移生 侯吉华 廖夫生 朱大诚

(1.江西中医药大学基础医学院 江西 南昌 330004；2.江西中医药大学药学院 江西 南昌 330004)

水蛭，俗称蚂蝗。其性咸、苦、平，归肝经，有破血、逐瘀、通经等功效，临床上用于治癥瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤等。其药理作用为抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等[1]，可单方或组方用于肿瘤的治疗[2]。本课题组前期研究发现，水蛭提取物对HL-60细胞生长有抑制作用[3]，为进一步深入研究，本课题组进行了水蛭提取物对HL-60细胞增殖与分化影响的实验。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养方法 HL-60细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，由江西中医药大学基础医学院实验中心保存。将HL-60细胞置于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培养基中(37℃，5%CO2饱和湿度)，培养至细胞处于对数生长期，备用于后续实验。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基和新生小牛血清为美国GIBCO公司产品，全反式维甲酸(All trans-retinoic acid, ATRA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、佛波酯(TPA)均为美国Sigma公司产品，小鼠抗人CD11b、CD14 FITC荧光标记抗体为Immunotech公司产品。

1.3 药物 水蛭原药材购于江西中医药大学第一附属医院中药房，并经我校中药资源学科组邓可众副教授鉴定且符合国家中药临床应用标准。水蛭用超微粉碎机粉碎，提取物以液氮快速冻融法制备[4]：取水蛭超微粉1.5g置15mL离心管内，加10mL无菌双蒸水制成混悬液，再将离心管置液氮内5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重复3次，再3000 r/min离心10min。取上清液过滤，滤液冷冻干燥18h即得水蛭冻干粉，-20℃保存备用，临用前用培养基配成实验所需浓度工作液，再经0.22μm无菌滤器正压过滤除菌。

1.4 MTT试验 取对数生长期的HL-60细胞，以5.0×104/mL细胞浓度置于96孔培养板内培养，同时用水蛭提取物(根据前期实验结果，设0.7g、1.4g、2.8g/L)再处理HL-60细胞48h，同时设对照孔，到时间点后各孔加入MTT液(20μL/孔)，每组10个复孔，4h后终止培养，以1000r/min离心5min，去除上清，加入DMSO(150 μL/孔)使结晶物溶解，用自动酶标仪在波长490nm处测吸光度A值，实验重复5次，得出量效关系。按下列公式计算细胞抑制率：细胞生长抑制率(%)=(对照孔A值-试验孔A值)/对照孔A值×100%。

1.5 NBT还原实验检测[5]HL-60细胞经过水蛭提取物处理48h后，收集各实验组的细胞(每组10个复孔)，用台盼蓝试剂检测细胞活性并计数，取含有1×106个活细胞的100μL细胞悬液，加入100μL含2 mg/L TPA的1% NBT试剂，放入37℃培养箱中继续培养1h，离心后丢弃上清液，每个实验组加入200μL的DMSO，混匀后加于96孔板，用酶标仪在波长570nm处测量吸光度A值，吸光度A值越大表示细胞分化程度越高。实验重复5次。

1.6 FCM检测HL-60细胞膜表面CD11b、CD14抗原 HL-60细胞经过水蛭提取物处理48h后，收集各实验组的细胞，用台盼蓝试剂检测细胞活性并计数，取含有5×105个细胞，PBS漂洗1次，用100μL PBS重悬细胞，分别加入20μL相应抗体，避光孵育30min，流式细胞仪(FCM)检测，每个样本至少检测1×104个细胞。实验重复5次。

2 结果

2.1 水蛭提取物对HL-60细胞增殖的抑制作用 各浓度的水蛭提取物处理HL-60细胞48h后，MTT检测结果显示,水蛭提取物以剂量依赖性方式抑制HL-60细胞增殖，抑制率随水蛭提取物浓度增高而增加。各试验组与正常组比较均有统计学差异(P<0.05，P<0.01)，详见表1。

表1 水蛭提取物对HL-60细胞增殖的抑制作用

表2 水蛭提取物对HL-60细胞分化及CD11b、CD14表达的影响

图1 水蛭提取物影响HL-60细胞表达CD11b图

2.2 水蛭提取物对HL-60细胞分化的影响 成熟的髓系细胞(粒细胞、单核细胞)具有吞噬能力，受到TPA刺激后可将黄色的NBT还原，生成蓝紫色的甲簪沉淀，因此细胞对NBT的还原能力可在一定程度上反映其分化水平[5]。检测结果显示，水蛭提取物以剂量依赖性方式诱导HL-60细胞分化，诱导率随水蛭提取物浓度增高而增加。各试验组与正常组比较均有统计学差异(P<0.05，P<0.01)，详见表2。

2.3 水蛭提取物对HL-60细胞膜表面CD11b、CD14表达的影响 CD11b、CD14分别是粒系及单核系分化的标记物。经各浓度的水蛭提取物处理48h后，HL-60细胞膜表面CD11b表达升高，且随水蛭提取物浓度增高而增加，各试验组与正常对照组比较均有统计学差异(P<0.01)，见表2、图1。这表明水蛭提取物可以诱导HL-60细胞向成熟粒系分化，这种促分化的效果随着水蛭提取物浓度的增加而明显。

CD14在正常对照组的HL-60细胞与各浓度水蛭提取物处理的HL-60细胞中表达率比较，无统计学差异，表明水蛭提取物诱导的HL-60细胞不是朝着单核系方向分化。

3 讨论

水蛭始载于《神农本草经》，有破血、逐瘀、通经等功效，广泛用于心脑血管及血栓性疾病的治疗，水蛭也是治疗肿瘤疾病常用的一味活血药。现代研究发现，水蛭抗肿瘤的主要活性成份有凝血酶抑制剂及蛋白酶抑制剂等，含量中主要是水蛭素、溶纤素等[6]。我们前期研究发现，水蛭提取物浓度高于0.1mg/mL时对HL-60细胞有明显的抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。经计算，作用HL-60细胞48h时的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故本研究中将水蛭提取物设为0.7g、1.4g、2.8g/L(低、中、高剂量)三个剂量作用HL-60细胞48h时间段进行研究[3]。

NBT还原实验和表面分化抗原的检测两个实验的结合广泛用于白血病诱导分化实验的研究。NBT的还原试验发现，水蛭提取物在0.7～2.8g/L剂量范围内以剂量依赖性方式诱导HL-60细胞分化，且诱导率随水蛭提取物浓度增高而增加；进一步运用流式细胞仪检测水蛭提取物对HL-60细胞膜表面CD11b、CD14的表达发现，经各浓度的水蛭提取物处理48h后，HL-60细胞膜表面CD11b表达升高，且随水蛭提取物浓度增高而增加，但水蛭提取物处理HL-60细胞前后的CD14表达均为阴性。这说明水蛭提取物诱导HL-60细胞分化是通过诱导HL-60细胞向成熟粒系方向分化，而非向单核系分化。

肿瘤细胞的增殖能力与其分化程度密切相关，分化程度差的细胞往往比分化程度好的细胞增殖活跃，故临床上常通过诱导肿瘤细胞向成熟细胞方向分化、降低细胞增殖，以达到治疗肿瘤的目的[7]。研究表明，白血病的发生发展与细胞增殖和分化之间的平衡失调有关，表现为增殖失控而分化受阻。如果药物可以诱导白血病细胞向正常体细胞分化，将明显减轻化疗药物引起的副作用[8]。我们的实验表明，水蛭提取物有良好的抑制HL-60细胞增殖作用，2.8g/L的水蛭提取物抑制HL-60细胞增殖率达62.25%；进一步研究发现，水蛭提取物也能诱导HL-60细胞向成熟粒系方向分化，2.8g/L的水蛭提取物诱导HL-60细胞的CD11b表达率达34.77%±5.58%。这就说明水蛭提取物抑制HL-60细胞增殖的机理之一是通过诱导HL-60细胞向成熟粒系方向分化而发挥作用的；另外，水蛭提取物抑制HL-60细胞增殖可能还有其它作用机理，有待进一步研究。

[1]周乐，赵文静，常惟智.水蛭的药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息，2012，29(1)：132-133.

[2]张娟，张媛.浅谈水蛭在肿瘤疾病中的运用[J].湖南中医杂志，2006，22(4)：69.

[3]肖移生，廖夫生，赵志冬，等.水蛭提取物对人白血病HL-60细胞体外抑制作用研究[J].江西中医学院学报，2013，25(4)：63-65.

[4]郭永良，田雪飞，肖竺.水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞体外抑制作用研究[J].中国中医药信息杂志，2009，16(8)：30-31.

[5]Li D, Wang Z, Chen H, et al. Isoliquiritigenin induces monocytic differentiation of HL-60 cells[J]. Free Radic Biol Med, 2009, 46(6) :731-736.

[6]王艳，杨培民，代龙，等.水蛭提取方法及生理活性的研究[J].中国生化药物杂志，2012，33(1)：27-30.

[7]Ruch JM, Kim EJ. Hedgehog signaling pathway and cancer therapeutics: progress to date[J]. Drugs, 2013,73(7): 613-623.

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