罗布麻叶抗抑郁药理作用的实验比较*

★ 郭慧玲 郭三保 赵晓娟 胡律江 胡志方* 肖小梅 许茜茜

(1.江西中医药大学 江西 南昌 330006；2.江西中医药高等专科学校 江西 抚州 344000)

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的干燥叶,在我国分布广泛，资源丰富。罗布麻叶中含有黄酮类化合物、儿茶素等，大量实验研究表明其对防治高血压和高血脂有良好的效果[1,2]。近几年，研究报道罗布麻叶亦具有良好的抗抑郁作用，其作用可能主要与其中的黄酮类化合物特别是金丝桃苷和异槲皮素有关[3]。中药抗抑郁的作用机制复杂，单一成分并不一定能代替药材整体成分的药理作用，因此，本实验采用罗布麻叶提取液，以总黄酮含量为考察指标，优化纯化工艺，并比较纯化前后对抗抑郁作用的影响，为罗布麻叶抗抑郁作用制剂的开发奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器 Megafugel O R高速大容量离心机(德国Thermo公司)，BT25S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KDM型调温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)，UV759紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器公司)。

1.2 实验药材与试剂 罗布麻叶购于江西省南昌市会好康大药房(产地：天津)，由本校生药教研室邓可众副教授鉴定为正品罗布麻。金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111521-201205)；盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司，批号：2072A)；CMC-Na(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110509)；净品级D101大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；无水乙醇、硫酸、石油醚等试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 清洁级KM小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，购自江西中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(赣)2011-0001，实验前小鼠适应环境7d。

2 实验方法

2.1 罗布麻叶的提取与纯化

2.1.1 罗布麻叶提取物的制备 依据文献[4]，取罗布麻叶80g置于圆底烧瓶中，加800mL40%乙醇水溶液，于70℃下回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，按质量平均分成两份，编号为A、B。从A中取浸膏1.1600g(相当于生药材量6g)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶，编号为C，剩余浸膏编号为D，备用。

2.1.2 罗布麻叶提取纯化物的制备 依据文献[5]，取B用纯化水溶解，离心取上清液，石油醚脱脂后浓缩成浸膏，将浸膏溶于热水，用硫酸调节为pH=4，过滤，滤液上D101大孔树脂柱，依次用水和50%乙醇溶液洗脱。收集乙醇洗脱液并浓缩成浸膏，取浸膏0.3175g(相当于生药材量6g)，用甲醇溶解并定溶于100mL容量瓶编号为E，剩余浸膏编号为F,备用。

2.2 罗布麻叶总黄酮含量测定方法的建立

2.2.1 对照品的制备 取经五氧化二磷干燥的金丝桃苷对照品，精密称定10.70mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.2140mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 分析方法的建立 精密量取上述对照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL于25mL容量瓶中，分别加纯化水至6mL，精密加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，再加入4%氢氧化钠溶液10mL，摇匀，用甲醇补足体积至刻度，摇匀，放置15min后，以相应的试剂做空白对照，采用紫外分光光度法，于507nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=16.077C-0.0026(r=0.9999)，金丝桃苷在0.0043～0.0343mg/mL呈良好的线性关系。本方法的精密度、重现性试验的RSD分别为2.91%，2.77%，回收率为98.65%。

2.2.3 样品的测定 分别取0.5mL C和E，按“2.2.2”项所述方法显色，于507nm波长处测定吸光度，由回归方程计算出样品中总黄酮的含量，结果见表1。

表1 样品测定结果

2.3 罗布麻叶灌胃液样品的制备 AT(罗布麻叶提取物)和AC(罗布麻叶纯化物)灌胃液的制备：分别取D和F浸膏，用1%CMC-Na定容成浓度为以生药量计含罗布麻叶0.4，0.2g/mL的药液，分别编号为AT高、低剂量组、AC高、低剂量组，备用。

2.4 动物分组及给药 将小鼠随机分为6组，每组10只雌雄各半，分组情况如下：空白组(给予20mL/kg的1%的CMC-Na水溶液)，阳性对照组(取盐酸氟西汀胶囊50mg用1%的CMC-Na定容于50mL容量瓶即浓度为1mg/mL)，AT高剂量组、AT低剂量组、AC高剂量组、AC低剂量组。各组均连续灌胃(ig)给药10d，每天1次，每次0.4mL/20g，末次给药1 h后测试。

2.5 抗抑郁实验

2.5.1 小鼠悬尾实验(TST) 参照Steru等[6]建立的方法，并加以修改，将单个小鼠尾端(在距尾尖部约2cm处)用胶布粘于悬尾箱(35cm×35cm×20cm)上部支架上，使小鼠成倒挂状态且头部离箱底约5cm。小鼠为了克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时间出现间断性不动，表现出失望状态。悬挂时间为6min，记录后4min内悬尾累计不动时间。结果见表2。

2.5.2 强迫游泳实验(FST) 参照Porsolt等[7]建立的方法，并加以修改，将小鼠单独放入高25cm、直径12cm的圆柱形玻璃缸中，缸内水深10cm，水温25±2℃，从小鼠放入水后计时6min，记录后4min内游泳累计不动时间。结果见表2。

2.5.3 开场实验(OFT) 参照Archer等[8]建立的方法。敞箱装置为长和宽各40cm、高25cm、底面划分为16个等边方格的纸箱．内面用黑漆涂满。将小鼠放人中心方格内，观察小鼠4min，计算后3min穿越格数(四爪均进入的方格方可计数)，彻底清洁敞箱后再进行下1只小鼠的观察。结果见表2。

3 实验结果

3.1 罗布麻叶AT和AC对小鼠TST不动时间的影响 与空白组对比，AT高剂量、阳性药FH和AC高、低剂量均可显著缩短悬尾不动时间(P<0.05)，提示在既定给药方案内，AT、FH和AC在TST实验中均有显著的抗抑郁作用，且AC呈现出良好的量效关系；罗布麻叶AT低剂量对此有缩短趋势，但无统计学差异(P>0.05)，提示AT低剂量在既定给药方案内没有显著的抗抑郁作用，见表2。

3.2 罗布麻叶AT和AC对小鼠FST不动时间的影响 与空白组对比，AT高剂量、阳性药FH和AC高、低剂量可显著缩短悬尾不动时间(P<0.05)，提示在既定给药方案内，AT、FH和AC在FST实验中均有显著的抗抑郁作用；罗布麻叶AT低剂量对此有缩短趋势，但无统计学差异(P>0.05)，提示AT低剂量在既定给药方案内没有显著的抗抑郁作用，见表2。

3.3 罗布麻叶AT和AC对小鼠OFT不动时间的影响 小鼠OFT穿格次数，各组间比较均无显著性差异(P>0.05)，结果见表2。

表2 罗布麻叶总黄酮对小鼠TST和FST不动时间及OFT穿格次数的影响±s，n=10)

4 讨论

TST和FST是最常用的抗抑郁药物初筛模型，其具有操作简单、快捷、敏感度高等特点[9]。本实验采用小鼠TST和FST抑郁症模型比较罗布麻叶提取液纯化前后的抗抑郁效果，实验结果表明，提取液纯化后由于总黄酮含量的增加，在等剂量的情况下AC比AT的抗抑郁效果更显著，且存在显著性差异(P<0.05)。

TST和FST抑郁症模型几乎对所有的抗抑郁药都有很高的敏感性，但中药中若含中枢兴奋性成分可能影响小鼠的自主活动，出现假阳性结果[10]。为避免可能出现的假阳性结果，本文采用OFT实验考察各实验组对小鼠自主活动的影响，结果显示各实验组对小鼠OFT穿格次数无明显影响，从而排除罗布麻叶中可能含有中枢兴奋性成分造成的假阳性结果。

综上所述，罗布麻叶具有抗抑郁作用且其药效与总黄酮的含量有关，但其作用机制尚未明确，有待进一步研究。

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