结核感染T细胞斑点试验对肺结核的临床诊断价值

李林阳 陈林利 李 琦

结核病一直是人们关注的全球性健康问题。据世界卫生组织统计，全球约有1/3人口受到结核分枝杆菌感染。结核病在我国的发病率位居世界第二，且发病率呈逐年上升趋势，每年约有13万人死于结核病[1]。结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。传统的结核病诊断方法如痰涂片抗酸染色、结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)、结核抗体(tuberculosis antibody, TB-Ab)、血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)及影像学检查等敏感性及特异性不高，而“结核分枝杆菌培养”作为诊断结核的金标准，特异性虽高，但敏感性低，并且培养时间较长。因此寻找敏感性及特异性较高的快速诊断结核感染的检测方法对于结核疾病的控制与预防十分重要。结核感染T细胞斑点试验(Tuberculous infection of T cells spot test, T-SPOT.TB)是由酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)试验发展而来检测结核疾病的新型方法。其作用原理为使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，通过细胞因子干扰素(interferon-γ, IFN-γ)的分泌检测抗原特异性T淋巴细胞的应答反应情况，进而对患者的结核感染状态进行判断。本研究通过回顾性分析，对比T-SPOT.TB试验和其它常规方法检测结果，评价T-SPOT.TB试验的临床辅助诊断价值。

对象与方法

一、研究对象

回顾分析2014年1月至2014年7月入住我院呼吸科的患者，共122例，其中确诊肺结核者64例，其中男35例，女29例，年龄21～78岁，平均年龄 48.3岁，其中菌阳28例，病理确诊17例，抗结核治疗病灶明显吸收者19例；非结核组患者58例，其中男26例，女32例，年龄范围20～81岁，平均年龄51.7岁，均通过临床症状、实验室检查、病理、影像学及临床疗效明确排除结核可能。两组患者均采集详细病史，并完成T-SPOT.TB、血沉、结核抗体、痰涂片抗酸染色、结核菌素纯蛋白衍生物(purified prote in derivatives, PPD)皮试等检查。

1.入选标准

结核组：菌阳(痰液、纤支镜刷检及灌洗液)；病理明确干酪样坏死；经诊断性抗结核治疗临床症状明显改善，影像学病灶明显吸收。

非结核组：菌阴(痰液、纤支镜刷检及灌洗液)；病理诊断为明确非干酪样坏死；无结核密切接触史；经非抗结核治疗临床症状及病灶影像学明显改善。

2.排除标准: 以上病例均满足：HIV抗体阴性；近期无严重病毒感染史；无严重的肝肾功能衰竭；近期无输血及PET-CT；无免疫抑制剂用药史及放化疗治疗。

二、研究方法

1. ESR：男患>15 mm/1 h 女患>20 mm/1 h为阳性 反之为阴性。

2. 痰涂片抗酸染色：每例患者至少3次痰检，1次为阳性即可。

3. PPD试验：对所有入选患者左前臂曲侧中上部1/3处皮下注射5 IU(0.1 ml)人型纯蛋白衍生物(PPD)试剂，实验后48～72 h观察和记录结果，硬结直径≥5 mm判定为阳性。

4. TB-Ab：具体操作按试剂盒。

5. T-SPOT.TB 检测技术

(1)操作步骤：采集肝素锂抗凝的外周血5 ml行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分离，用全血模式进行细胞计数，配制成终浓度为每100ul中含25万个单个核细胞的细胞悬液；在每个样本的板条上按顺序设置阴性对照、抗原A(早期分泌性靶抗原6 ESAT-6)、抗原B(滤液培养蛋白10 CFP-10)、阳性对照，再按上述顺序，在4个孔中分别加入已制备好的终浓度细胞悬液100 μl，将培养板放入37.0 ℃、5% CO2浓度培养箱中培养16～20 h，PBS洗板4次；每孔加入50 μl新鲜配制的酶标二抗工作液，在2～8 ℃条件下孵育1 h，PBS洗板4次；每孔加入50 μl显色液，避光显色7～12 min，蒸馏水终止显色3～4次，使用滤纸拍板，自然干燥后进行结果判读，干燥后的板条可在干燥避光条件下长期保存。

(2)结果判读：阴性对照孔斑点数为0～5个时：(抗原A孔或抗原B孔斑点数)减去(阴性对照孔斑点数)≥6，为“阳性”；阴性对照孔斑点数为6～10个时：(抗原A孔或抗原B孔斑点数)≥2*(阴性对照孔斑点数)，为“阳性”；如不符合上述标准，且阳性对照孔正常时检测结果为“阴性”。

三、统计学方法

数据分析用SPSS 17.0软件，计数资料采用卡方检验，以P<0.05表示差异有统计学意义，T-SPOT.TB检测与传统检测方法的灵敏度、特异度两两比较的检验水准α′取0.0167。

结 果

122例患者中，结核患者64例，非结核患者58例，T-SPOT.TB检测肺结核灵敏度为90.63%， 特异度为87.93%， 假阴性率为9.37% ，假阳性率为12.07%，阳性预测值为89.23%，准确度符合率为89.34% 。T-SPOT.TB诊断结核的灵敏度显著高于TB-Ab(χ2=25.301，P<0.001)和ESR(χ2=5.489,P=0.019)，但与PPD无显著差异(χ2=0.321，P=0.571)；特异度显著高于PPD(χ2=22.543，P<0.001)、TB-Ab(χ2=5.254，P=0.022)和ESR(χ2=20.993，P<0.001)；阳性预测值89.23%显著高于PPD(χ2=12.266，P<0.001)、TB-Ab(χ2=9.622，P=0.002)和ESR(χ2=14.176，P<0.001)；诊断符合率89.34%显著高于PPD(χ2=16.521，P<0.001)、TB-Ab(χ2=28.024，P<0.001)和ESR(χ2=24.344，P<0.001)，见表1。确诊结核患者中，涂阳、涂阴两组T-SPOT.TB检测阳性检出率分别为92.86%，88.89%，差别无统计学意义(P>0.05)，见表2。

讨 论

结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO估计, 全球有约20 亿人感染结核分枝杆菌,每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一, 每年约有13万人死于结核病。随着老年患者、耐药患者、合并糖尿病、免疫损害等肺结核患者的增多，结核症状易被并发症和其它症状掩盖，给临床诊断带来极大的困难。因此寻找敏感性及特异性较高的快速诊断结核感染的检测方法不仅可使患者尽早恢复健康，而且是消除传染源、控制结核病流行最重要的措施。

表1 4种检查方法的灵敏度、特异度、阳性预测值、准确度符合率比较

注：T-SPOT.TB：T结核感染细胞斑点试验；PPD试验：纯蛋白衍生物；TB-Ab：结核抗体； ESR：血沉

表2 64例确诊肺结核患者涂阳、涂阴组T-SPOT.TB试验阳性检出率比较

临床上传统诊断结核的方法存在诸多缺陷，TST虽然快速，但在易受结核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低，导致临床漏诊率高；PPD是200多种蛋白的混合物, 其中很多是非结核分枝杆菌及卡介苗(BacillusCalmette-Gurin, BCG)的共同抗原成分, 尤其在普遍接种BCG 的地区造成较高的“假阳性”率。而且，皮试的操作和结果的解释存在主观依赖性，降低了检查的准确性；组织病理学检查为有创性，风险大，达不到快速诊断目的；痰涂片抗酸染色尽管简便、快捷，但敏感性及特异性低。大量资料显示，当痰液中分枝杆菌含量为1000～10 000/ml时，其痰涂片阳性率为40%～50%，表明大量的涂阴结核患者未被检出，而且涂阳患者也不能区分是结核菌还是非结核分枝杆菌。“结核分枝杆菌培养”作为诊断结核的金标准，特异性虽高但敏感性低，并且培养时间一般为2～8周，并且受到标本细菌数量的影响，容易出现假阴性。

T-SPOT实验结合了酶联免疫斑点技术(即ELISPOT技术)与γ-干扰素释放试验，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。结核感染后体内长期存在抗原特异性T细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放γ-干扰素。实验中利用ESAT6和CFP10两种结核特异性抗原刺激外周血中结核特异性T淋巴细胞分泌γ-干扰素，并通过ELISPOT方法检测γ-干扰素的释放水平(即斑点的多少)，从而判断机体是否感染了结核杆菌。对活动性结核分枝杆菌感染具有较高的敏感性[2-3]。ESAT6和CFP10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域，且仅有结核分枝杆菌复合群存在RD1区，所有的卡介苗和大多数环境分枝杆菌均缺失该区域。因此，该检测不受卡介苗接种、环境分枝杆菌感染的影响，特异性强，是目前早期发现结核病最有效的检测手段。

研究显示，T-SPOT.TB检测对于潜伏性感染及活动性结核具有较高敏感性和特异性。Madariaga等[4]对47例痰菌阳性患者进行检测，结果表明T-SPOT.TB检测诊断活动性肺结核比结核菌素敏感性高。Lalvani等[5-6]的研究显示T-SPOT.TB检测对免疫功能正常的成年人活动性结核诊断的敏感性为83～97%，综合敏感性为90%。赵静等[7]对于43例菌阳肺结核患者进行T-SPOT.TB检测敏感性为93.0%，且T-SPOT.TB检测的特异性明显高于血结核抗体检测。本研究结果显示T-SPOT.TB检测诊断肺结核病的敏感度为90.63% 特异性87.93% 假阴性率9.37% 假阳性率12.07%，符合准确率89.34% 。本研究结果与文献报道相近。本试验结果中痰涂片抗酸染色阳性率为43.75%(28/64)，显然低于T-SPOT.TB阳性率90.62%(58/64)，尽管PPD试验敏感性与T-SPOT.TB相近，但PPD试验特异性仅为46.55%，显著低于T-SPOT.TB。有Meta分析指出PPD的诊断敏感性为78.7%～81.6%，然而其特异性仅为52.4%～57.9%[8]。本试验结果中PPD特异性为46.55%，低于文献报道，可能是由于我国卡介苗预防接种率高，导致PPD假阳性率增高所致。T-SPOT.TB则避免了卡介苗、非结核杆菌的交叉反应，大大提高了特异性，故在卡介苗高接种率的我国推广T-SPOT.TB检测意义重大。2006年Ferrara等[9]试验研究得出T-SPOT.TB与PPD两种方法在诊断结核感染的一致率为75.9%。魏娟等[10]通过试验也得出两者在诊断结核感染有较好的吻合性，因此T-SPOT.TB在临床中结合PPD结果能提高诊断效率。

在临床实践中，因受痰菌含量的影响，导致痰菌涂阳率低下，临床大量痰菌涂阴的结核患者易漏诊。确诊结核患者中，涂阳、涂阴两组T-SPOT.TB检测阳性检出率分别92.86%，88.89%，P>0.05，提示T-SPOT.TB检测与结核患者是否排菌无关，明显降低了漏诊率。结核组中，T-SPOT.TB检测有6例阴性，均为入院前抗结核治疗，导致效应T细胞消失，使斑点数减少，呈阴性。有相关报道指出，治疗有效的病例T-SPOT.TB斑点数减少，甚至阴性。因此T-SPOT.TB检测可作为抗结核疗效的评估。尽管T-SPOT.TB 难以区分活动性结核和潜伏性结核感染，但相关文献报告T-SPOT.TB检测仍然存在着结核活动程度越高斑点数越多的趋势，即T-SPOT.TB的斑点数越多, 发生活动性结核的可能性越大，而且短期内有过结核接触史的患者T-SPOT.TB的斑点数较多时更有意义[11-12]。此外，对于T-SPOT.TB 阳性的人群，定期的复查监测斑点数的变化是很有必要的。如果T-SPOT.TB 的斑点数在短时间内显著增加，则强烈提示体内结核活动，这可为临床抗结核治疗提供很重要的依据。

综上所述，T-SPOT.TB检测是以ELISA POT 技术检测结核感染的新方法，ELISPOT 技术是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术，是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一，其灵敏度优于结核抗体、抗酸杆菌，特异度优于PPD、血沉，准确度优于传统诊断结核的方法，对抗结核疗效有评估价值，是早期快速诊断，有效避免漏诊、误诊的方法。在结核病高发的我国值得推广。

参 考 文 献

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9 Ferrara G, Losi M, D′Amico R, et al. Use in routine clinical practice Of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis：a prospective study[J]. Lancet, 2006, 367(9519): 1328-1334.

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