Siah2调控脯氨酰羟化酶3表达在非小细胞肺癌中的临床意义

潘坤 李鹏 张泽明 赵学琴 冯欣

·论著·

Siah2调控脯氨酰羟化酶3表达在非小细胞肺癌中的临床意义

潘坤 李鹏 张泽明 赵学琴 冯欣

目的观察Siah2(seven in absentia2)及脯氨酰羟化酶3(prolyl hydroxylase 3，PHD3)在人非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达，并探讨上述两者差异表达在非小细胞肺癌发病过程中的临床意义。方法应用RT-PCR检测非小细胞肺癌患者89例肿瘤及癌旁正常肺组织标本Siah2、PHD3 mRNA表达情况，Western blot检测上述指标的蛋白质表达水平，并分析其与肺癌临床特征的关系。结果非小细胞肺癌患者肿瘤组织中Siah2蛋白及mRNA表达量均明显高于癌旁组织(P<0.05)，PHD3蛋白的表达在肿瘤组织中低于癌旁组织(P<0.05)， PHD3 mRNA在肿瘤组织中的表达高于癌旁组织，Siah2蛋白与PHD3蛋白表达呈负相关(r=-0.735，P<0.05)，Siah2 蛋白与Siah2 mRNA表达呈正相关(r=0.821，P<0.05)。结论Siah2可能通过调控PHD3表达水平在非小细胞肺癌发病中发挥作用。

Siah2；脯氨酰羟化酶；低氧诱导因子-1α；癌，非小细胞肺

实体肿瘤发生发展过程中的一个典型特征是肿瘤微环境的低氧，目前已证实低氧诱导因子1-α(hypoxiα inducible factor 1 αlph， HIF-1α) 大量表达于人体多种肿瘤中，参与了肿瘤的生长繁殖、远处转移、血管生成、细胞凋亡等[1]，HIF-1α降解的关键是脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)催化HIF-1α脯氨酰残基羟基化，而催化此过程的羟化酶便是全过程的限速酶[2]，因此，对HIF-1α蛋白表达水平的调控也就集中到对羟化酶的调节水平上来。Siah2是果蝇sina(seven in absentia2) 基因产物的类似物，具有E3泛素连接酶活性，因此可介导HDAC3、MYPT1、TIN2等多种蛋白经泛素蛋白酶体途径降解[3-5]，离体细胞试验发现PHD3也是Siah2的作用底物，并且证明Siah2可使PHD3表达水平下降。在非小细胞肺癌的发展过程中是否也存在同样的调控机制尚不明确，本研究选取89例非小细胞肺癌患者肿瘤组织及癌旁正常对照肺组织，应用RT-PCR和 Western blot 检测Siah2、PHD3在肿瘤组织及癌旁组织的表达情况，两者的表达是否具有相关性，并进一步探讨两者差异表达在非小细胞肺癌发病过程中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河北大学附属医院2010年7月至2012年4月经手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌患者89例的肺癌组织、癌旁正常肺组织(距离肿瘤边缘>5 cm以上)样本进行试验，89例患者中，男54例，女35例；年龄37～64岁，中位年龄58岁。其中有淋巴结转移组51例，无淋巴结转移组38例，TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。临床分期标准：按照第7版美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)制订的TNM分期标准分类。上述患者术前均未行放疗、化疗、介入及中医中药等抗肿瘤治疗，均有完整的病例资料并全部知情同意。Western blot检测所用的肿瘤肺组织及癌旁正常肺组织切除后立即置于-70℃冰冻保存。

1.2 实验方法 RT-PCR：按照上海生工TRIZOL试剂说明书提取总RNA，逆转录之后行PCR，扩增引物由上海生工合成，PCR 反应参数：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，适宜温度退火30 s，72℃延伸60 s，反应适当循环后72℃延伸10 min。得到RT-PCR产物后经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统对扩增产物条带吸光度半定量分析。检测指标引物序列、退火温度、产物长度、循环数等参数见表1。

表1 RT-PCR实验中PHD3、Siah2及内参照β-actin的详细参数

Western blot：取0.1 g肺组织标本剪碎后加入RIPΑ 裂解液，冰浴匀浆，4℃条件下10 000 g离心，将沉淀去除后上清液即为肺组织总蛋白，将蛋白样品稀释至相等浓度后分装，置于-80℃冰冻保存备用。实验时应用微量进样器将等量蛋白质样品加至SDS-丙烯酰胺凝胶孔中， 200 V恒压电泳，转印至硝酸纤维膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，封闭液充分漂洗后加入二抗(1∶2 000)室温杂交1 h，漂洗后化学发光法发光，X线胶片显影，对扩增产物条带吸光度行半定量分析。

1.3 结果评定 上海Tanon Gis-2010图像分析系统对RT-PCR、Western blot产物条带行半定量分析，计算目的条带与内参照β-αctin的吸光度比值。

2 结果

2.1 Siah2 mRNA和蛋白在非小细胞肺癌组织及癌旁对照肺组织中的表达 RT-PCR结果显示，Siah2 mRNA在肿瘤组织中的表达高于其配对的癌旁对照肺组织，且其在肿瘤组织及癌旁组织的表达差异有统计学意义(P<0.05)， Western blot结果显示Siah2蛋白变化趋势符合其mRNA的变化趋势，在肿瘤组织中的表达高于其配对的癌旁对照肺组织(P<0.05)。Siah2的表达在肿瘤不同分期间差异亦有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2正常组及不同临床分期各组间Siah2、PHD3表达差异比较

组别PHD3mRNAPHD3蛋白Siah2mRNASiah2蛋白正常组(n=89)7.1±1.320.7±4.26.4±1.85.5±1.1NSCLCⅠ期(n=26)13.0±2.1*17.2±3.5*12.2±2.2*10.8±1.9*NSCLCⅡ期(n=34)16.5±3.2*#13.8±2.9*#14.7±2.9*#13.4±2.4*#NSCLCⅢ期(n=29)23.4±3.9*#△8.2±1.6*#△19.6±3.1*#△17.4±3.1*#△ F值370.104100.052275.834334.812 P值0.0000.0000.0000.000

注：与正常组比较，*P<0.05；与Ⅰ期组比较，#P<0.05；与Ⅱ期组比较，△P<0.05

2.2 PHD3 mRNA和蛋白在非小细胞肺癌组织及癌旁对照肺组织中的表达 RT-PCR结果显示，PHD3 mRNA在肿瘤组织中的表达高于其配对的癌旁对照肺组织，差异有统计学意义(P<0.05)， Western blot结果显示PHD3蛋白变化趋势与其mRNA的变化趋势相反，在肿瘤组织中的表达低于癌旁对照肺组织(P<0.05)，同时PHD3蛋白的表达在肿瘤不同病理分期各组间亦有差异，临床分期越晚，PHD3蛋白表达越低(P<0.05)。见表2。

2.3 肿瘤组织中Siah2与PHD3表达的相关性 直线相关分析表明，在肿瘤组，Siah2蛋白与PHD3蛋白表达呈负相关(r=-0.735，P<0.05)，Siah2 蛋白与Siah2 mRNA表达呈正相关(r=0.821，P<0.05)。

3 讨论

Siah2蛋白作为一种重要的E3泛素连接酶，可以识别一系列的底物蛋白，使其经泛素蛋白酶体途径降解，进而参与多种组织信号转导通路，在细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤发生等过程中发挥重要作用[6]。本实验发现，Siah2 mRNA 和蛋白质在癌旁对照肺组织中表达较少，肿瘤组织中其表达呈动态增长变化，且其mRNA 和蛋白质表达变化趋势在肿瘤不同临床分期各组间相一致，提示Siah2在非小细胞肺癌发生发展过程中可能通过自身转录水平的调控发挥作用。国内临床试验中，已证明Siah2在乳腺癌组织中高表达，并且Siah2的表达水平与肿瘤的临床病理分期有关[7]，在肝癌患者中，Siah2亦呈高表达状态，并通过Ras—ERK途径影响肿瘤的生物学特性[8]，Siah2可能是一个癌基因，在肝癌的发病过程中发挥作用[9]。国外有文献报导，通过应用维生素K3抑制Siah2的表达，可抑制黑色素瘤的发生发展[10]，同时还发现在胰腺癌细胞及肺癌细胞中均有Siah2的高表达，抑制Siah2的表达可显著抑制人胰腺癌或肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长[11,12]。本试验发现Siah2在非小细胞肺癌组织中高表达，同国内外所得试验结果基本一致，上述结果均提示，Siah2可能是一个癌基因，其表达水平动态增长可能在非小细胞癌的发生发展中发挥作用。

本实验发现，PHD3的mRNA在肿瘤组织中的表达高于癌旁对照肺组织，Western blot结果显示PHD3蛋白变化趋势与其mRNA的变化趋势相反。多项研究表明，低氧可以诱导PHD3 mRNA的表达，本实验中PHD3 mRNA的动态变化与非小细胞肺癌肿瘤内部的低氧环境是相符的。本实验还发现PHD3 mRNA和蛋白的变化趋势不相符，肿瘤组织中PHD3 mRNA的表达是升高的，而其蛋白的表达水平呈下降趋势，提示肿瘤组织中PHD3可能存在某种蛋白水平的调控。研究已发现多种生物分子可通过不同通路调控PHD3的表达，并进而影响HIF-1α的稳定性，Siah2是最近研究较多的一个热点。多项研究结果证实，Siah2具有促进肿瘤发生和发展的生物学功能，其可通过多种通路影响肿瘤生长和侵袭的进程，Siah2/PHD3/HIF-1α通路是其中较为重要的一条通路[13]。国外离体细胞试验研究发现，在氧浓度为2%～5%情况下，Siah2可使PHD3经蛋白酶体途径降解，从而降低PHD3水平，减弱PHD3对HIF-1α转录活性的抑制[14]。不管在常氧还是在缺氧条件下Siah2在人类293T细胞都可引起PHD3表达水平下降，进而引起与之相对应的HIF-1α蓄积。在Siah2被抑制表达的细胞PHD3蛋白稳定性明显增强，HIF-1α及其靶基因表达也明显减低。研究人员将蛋白酶体降解途径的抑制剂MG101,MG132等加入Siah2与PHD3的反应混合物中，结果发现PHD3的降解受到抑制，充分说明了PHD3的降解是通过Siah2介导的蛋白酶体途径实现的。本实验发现Siah2蛋白水平在肿瘤组表达增高，而PHD3蛋白表达水平在肿瘤组呈下降趋势，Siah2蛋白表达水平与PHD3蛋白表达水平呈负相关，因此可以推测，在非小细胞肺癌组织中，PHD3蛋白表达水平的下降可能与Siah2的高表达有关。

综上所述，Siah2在非小细胞肺癌组织中高表达，其可能通过调控PHD3的水平进而影响HIF-1α的稳定性，进而在非小细胞肺癌的发生发展中发挥作用。阐明Siah2对PHD3的调控机制对于非小细胞肺癌的临床诊断和治疗具有重要临床意义。

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Clinicalsignificanceofregulationofprolylhydroxylases3bySiah2innon-smallcelllungcancer

PANKun*,LIPeng,ZHANGZeming*,etal.*DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Hebei,Baoding071000,China

ObjectiveTo investigate the expression of Siah2(seven in absentia2) and prolyl hydroxylase 3(PHD3) in non-small cell lung cancer(NSCLC),and to elucidate their clinical significance.MethodsThe mRNA expression levels of Siah2 and PHD3 were detected by RT-PCR in 89 cases of NSCLC and adjacent normal lung tissues,and their protein expression levels were detected by Western Blot.ResultsThe expression levels of Siah2 mRNA and protein in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues(P<0.05).The expression levels of PHD3 mRNA in tumor tissues were obviously higher than those in adjacent tissues,however,the expression levels of PHD3 protein in tumor tissues were significantly lower than those in adjacent tissues(P<0.05).The expression of Siah2 protein was negatively correlated to that of PHD3 protein(r=-0.735,P<0.05),however,the expression of Siah2 protein was positively related with that of Siah2 mRNA(r=0.821,P<0.05).ConclusionSiah2 may play a role in pathogenesis of NSCLC by regulating PHD3 expression levels.

Siah2；prolyl hydroxylases; hypoxia inducible factor 1 α;carcinoma,non-small cell lung

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.002

071000 河北省保定市，河北大学附属医院呼吸内科(潘坤、张泽明、赵学琴、冯欣)；中国人民解放军第252医院心血管研究中心(李鹏)

R 734.2

A

1002-7386(2014)11-1608-03

2013-12-11)