BQ123对大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌的保护机制

刘燕 彭海兵 王建辉 王银环 杨秀红 张连元

·论著·

BQ123对大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌的保护机制

刘燕 彭海兵 王建辉 王银环 杨秀红 张连元

目的探讨大鼠肢体缺血再灌注(LIR)后骨骼肌细胞损伤变化,以及内皮素A(ETA)受体拮抗剂BQ123对其保护效应的机制。方法雄性Wistar 大鼠随机分为对照组(双后肢松弛环绕橡皮圈，不阻断血流)，LIR组(结扎大鼠双后肢根部4 h，恢复血流灌注4 h)和BQ123处理组(松带前15 min给予BQ123 7μg/kg，其他操作同LIR组)，每组8只。检测肢体缺血4 h再灌注4 h后各组骨骼肌组织中一氧化氮(NO)、内皮素(ET-1)以及NO/ET-1、活性氧(ROS)、髓过氧化物酶(MPO)、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶；采用原位脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL) 检测各组腓肠肌细胞的凋亡情况。结果LIR组与对照组相比较，骨骼肌组织NO、ET-1、ROS、 MPO和Ca2+含量均增加，NO/ET-1比值减小，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性降低，凋亡指数(AI)明显增高(P<0.01)；与LIR组比较，BQ123组骨骼肌组织NO含量升高，ET-1、ROS、MPO和Ca2+含量下降，NO/ET-1比值升高，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性升高，AI下降(P<0.01)。结论BQ123 对大鼠LIR后骨骼肌的保护作用与其拮抗ET-1的作用，改善微循环、减轻氧化损伤、细胞内钙超载有关。

再灌注损伤；骨骼肌；内皮缩血管肽1

肢体缺血再灌注(limb ischemia reperfusion，LIR)见于交通事故造成的肢体挤压伤、骨筋膜室综合征、断肢再植等。LIR这一常见病理过程不容忽视，其在引起缺血肢体损伤的同时，可进一步导致全身炎性反应和多器官功能障碍[1,2]。由于骨骼肌微血管结构和功能完整是实现骨骼肌再灌注的前提，因此，保护好微血管内皮的结构和功能是防治骨骼肌无复流和再灌注损伤的关键措施。内皮素(endothelin,ET)是血管内皮细胞产生的一种内皮收缩因子，ET-1存在ETA和ETB两种受体。ETA受体参与多种生物学事件，如血管收缩和缺血再灌注炎性损伤反应[3]。BQ123为选择性ETA受体阻断剂,本研究利用在体大鼠缺血-再灌注模型，研究BQ123药物后适应对LIR后骨骼肌损伤的具体保护机制。

1 资料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 10周龄雄性Wistar大鼠24只，体重200～250 g，由河南医科大学实验动物中心提供；NO、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶试剂盒购于南京建成生物制品公司；ET-1试剂盒购于解放军总医院科技开发中心放免所；TUNEL试剂盒购于北京中山生物试剂公司；BO123购于美国Sigma公司。Axiovert 200蔡司光学仪器购于上海,美国产SIGMA-2M/ETM低温高速离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备与分组:大鼠术前 12 h禁食，自由饮水。将实验大鼠随机分为LIR组、BQ123处理组和对照组，每组8只。LIR组：采用止血带法制作大鼠LIR模型，用橡皮圈环绕结扎大鼠双后肢根部，并经激光多普勒血流仪监测并证实血流被阻断,4 h 后松解橡皮带恢复血流灌注,再经过4 h 后放血处死动物。动物于松解肢体前30 min称重、麻醉，颈部正中切开皮肤，钝性分离左侧颈静脉并行静脉插管。BQ123处理组：操作同LIR组,松带前15 min经颈静脉滴注BQ123(7 μg/kg)。LIR组和对照组均于松带前15 min经颈静脉滴注0.9%氯化钠溶液(4 ml/kg)。

1.2.2 骨骼肌组织NO、ET-1、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量：实验结束时经腹主动脉放血致死动物后即刻取双侧腓肠肌组织,液氮速冻，-70℃储藏备用。用扭力天平称取冻存的骨骼肌组织200 mg，移入装有2 ml冷0.9%氯化钠溶液的匀浆管中，冰浴条件下制备骨骼肌组织匀浆。收集上清液采用放免法测定3组ET-1含量，采用生物化学法测定组织NO、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量。

1.2.3 骨骼肌细胞凋亡检测：每组随机腓肠肌放入10 ml/L中性甲醛固定、包埋、切片。采用TUNEL法测定骨骼肌细胞凋亡。采用BI-2000医学图像分析系统软件对腓肠肌组织切片进行分析，每个实验组分别选取相应切片，高倍镜下随机计数1 000个骨骼肌细胞核，平均100个细胞核中呈现阳性反应数目为AI。

2 结果

2.1 骨骼肌组织NO、ET-1、NO/ET-1、ROS和 MPO含量变化 LIR组与对照组比较，骨骼肌组织中NO、ET-1、ROS、MPO均明显升高，NO/ET-1比值下降(P<0.01)；BQ123组与LIR组比较，ET-1、ROS、MPO明显降低，但仍高于Control组，NO、升高，NO/ET-1比值升高(P<0.01)。见表1。

表1 3组骨骼肌组织NO、ET-1、NO/ET-1、ROS和MPO变化

组别NO(μmol/L)ET-1(ng/L)NO/ET-1ROS(U/mgprot)MPO(活力单位/克湿片)对照组8.00±1.8326.91±4.810.36±0.02108.20±4.230.51±0.10LIR组11.24±2.13*73.77±8.99*0.17±0.01*158.47±16.12*1.66±0.28*BQ123组13.59±2.07*#43.22±2.59*#0.30±0.03*#126.76±10.40*#1.10±0.19*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与LIR组比较，#P<0.01

2.2 3组骨骼肌组织Ca2+、Na+-K+-ATP酶 、Ca2+-ATP酶和凋亡的改变 LIR组与对照组比较，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶含量均明显降低，Ca2+升高,AI明显升高(P<0.01)；BQ123组与LIR组比较，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶升高，而Ca2+降低,AI明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 3组骨骼肌组织Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和AI变化

组别Ca2+(mmol/gprot)Na+-K+-ATP酶(umolPi/mgprot/hour)Ca2+-ATP酶(μmolPi/mgprot/h)AI对照组0.04±0.011.95±0.282.28±0.342.65±0.37LIR组0.14±0.04*0.84±0.10*1.06±0.16*20.08±2.15*BQ123组0.09±0.02*#1.35±0.25*#1.74±0.32*#14.10±2.30*#

注：与对照组比较，*P<0.01；与LIR组比较，#P<0.01

2.3 骨骼肌组织凋亡情况 TUNEL染色可见阳性的细胞核呈棕黄色，形状不规整，大小不一致。而正常细胞的细胞核被苏木素复染呈蓝色。见图1。

3 讨论

图1 3组骨骼肌组织(TUNEL×400)

Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶存在细胞膜上，是维持细胞功能正常和离子内环境稳定的基础。与对照组比较，LIR组骨骼肌组织ATP酶的活性均下降，提示骨骼肌细胞膜受到了损伤。同时，骨骼肌细胞凋亡增加。说明缺血4 h再灌注4 h，骨骼肌组织损伤加重。在LIR这一病理过程中，氧自由基、Ca2+超载、微循环障碍和酸中毒等都可能是破坏骨骼肌细胞、降低ATP酶活力和细胞死亡增加的因素。BQ123是特异性ETA受体阻断剂，可阻断ETA受体活性。BQ123组较LIR组ATP酶活性有所提高，骨骼肌细胞凋亡减少，骨骼肌损伤减轻。骨骼肌损伤指标在两组之间的差别提示BQl23对ET-1介导的大鼠LIR有明显的保护作用。BQ123几乎无抑制 ET-1结合ETB受体的作用[4]。有文献记载ETB受体可以清除循环中的ET[5]。还有报道认为血管内皮细胞的ETB受体激活后可抑制ET分泌，构成ET分泌的负反馈回路[6]。本实验观察到BQ123组骨骼肌组织ET-1含量下降，可能与上述两个原因有关。

ET是体内一类作用强大的内源性血管收缩因子，NO 作为一种血管舒张因子,并参与 ET 的清除。NO/ ET-1比值能说明两种生物活性物质对机体的作用何种占优势。赵璞等[7]报道BQ123可增加内皮源性NO产生，最终阻断ET-1所致的收缩血管平滑肌等作用。本结果显示,BQ123组较LIR组，NO生成增加，NO/ ET-1升高，明显抑制了ET-1收缩血管的作用，减轻血管阻力，在一定程度上增大了骨骼肌血液供应。中性粒细胞(PMN)在肢体局部的炎性反应中发挥重要角色，PMN通过“呼吸爆发”释放大量的氧自由基。ET-1可以对PMN发挥有效的趋化作用，并且这种炎性趋化作用是通过ETA受体进行的。ET-1可能通过刺激提高PMN表面粘附分子的表达来增加PMN的聚集[8]。LIR组MPO 活性的增高，说明组织中PMN数量增加。与对照组比较，LIR 后 4h，骨骼肌组织中ROS明显增加，提示机体处于氧化应激状态。有研究表明，一定剂量的BQ123可以有效减少脂多糖诱导自由基生成，提供心肌的抗氧化能力[9]。 BQ123组与LIR组比较，ROS及MPO 活性明显降低。提示，降低ET-1水平对PMN的聚集及氧自由基的损伤有抑制作用。ET-1 还可激活质膜钙转运,刺激肌浆网钙释放和细胞内钙离子通道,增加细胞内钙离子的释放[10]。可见，肢体缺血再灌注后，ET-1过度生成可促进Ca2+超载的发生。LIR后4 h，骨骼肌组织中Ca2+明显增多。应用BQ123后，明显降低了骨骼肌组织Ca2+含量，这也是其对LIR后骨骼肌的保护机制之一。

综上所述，ETA受体阻断剂BQ123对LIR后骨骼肌组织产生保护作用与其拮抗ET-1的作用，改善微循环、减轻氧化损伤、细胞内钙超载有关。

1 陈烨,周军,袁婉丽,等.电针预处理对肢体缺血再灌注大鼠生存、脑损伤及认知功能的影响.中国病理生理杂志,2013，29: 469-475.

2 朱娜,张连元,要瑞莉,等.肾上腺髓质素、内皮素-1对大鼠肢体缺血再灌注致心肌损伤的影响.中国现代医学杂志,2011,21:1331-1334.

3 Jia Y,Zhao Z,Xu M,et al.Prevention of renal ischemia-reperfusion injury by short hairpin RNA of endothelin A receptor in a rat model.Exp Biol Med,2012,237:894-902.

4 Ihara M,Ishikawa K,Fukuroda T,et al.In vitro biological profile of a highly potent novel endothelin(ET) antagonist BQ-123 selective for the ETA receptor.J Cardiovasc Pharmacol,1992,20:S11-14.

5 韩宝石,盖鲁粤.心血管系统内皮素B型受体研究进展.医学综述,2008,14:1799-1801.

6 刘宝华，陈惠孙，王代科.内皮素对肝、胃肠的作用研究进展.国外医学消化系疾病分册，1997，17:44-46.

7 赵璞,殷桂林,王荣平,等.内皮素-1受体拮抗剂(BQ-123)对大鼠肺缺血-再灌注损伤的保护作用.中华实验外科杂志,2009,26:1049-1051.

8 Lopez FA,Riesco A,Espinosa G,et al.Effect of endothelin-1 on neutrophil adhesion to endothelial cells and perfused heart.Circulation 1993,88: 1166-1171.

9 Piechota PA，Kleniewska P，Goraca A.The influence of ETA and ETB receptor blockers on LPS-induced oxidative stress and NF-κB signaling pathway in heart.Gen Physiol Biophys,2012,31:271-278.

10 陈敏生,刘世明,罗健东主编.心血管病学前沿-基础与临床.第1版.广州：广东科技出版社，2009.248-249.

ThemechanismoftheprotectiveeffectofBQ123onskeletalmuscleafterischemiareperfusionofhindlimbsofrats

LIUYan*,PENGHaibing,WANGJianhui*,etal.*BasicMedicineCollegeofHebeiUnitedUniversity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the injury of skeletal muscle after limbs ischemia reperfusion(LIR) in rats and to investigate the protective mechanism of endothelin-A receptor antagonist BQ123 on the skeletal muscle after LIR.MethodsThe male Wistar rats were randomly divided into three groups,with 8 rats in each group：control group(rubber band around the hind limbs relaxed,without blocking blood flow),LIR group(subjected to 4h of hind limb ischemia and 4h reperfusion),BQ123 treatment group(pretreated with BQ123 7μg/kg 15 minutes before reperfusion).The contents of initric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),NO/ET-1,reactive oxygen species(ROS),myeloperoxide(MPO),Ca2+,Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in skeletal muscle were detected.Apoptosis condition was examined by means of TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL).ResultsAs compared with those in control group,the contents of NO,ET-1,ROS,MPO and Ca2+in skeletal muscle tissue were significantly increased in LIR group,however,the levels of NO/ET-1,activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were decreased,and apoptosis index(AI) was significantly increased(P<0.01).As compared with those in LIR group,the contents of NO were increased,the levels of ET-1,ROS,MPO and Ca2+in skeletal muscle tissue were decreased,the ratio of NO/ET-1 and the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase were obviously increased,but AI was significantly decreased in BQ123 treatment group(P<0.01).ConclusionThe protective effect of BQ123 on skeletal muscle of rats after LIR may be related with its effects of antagonizing ET-1,improving microcirculation,alleviating oxidative damage and the calcium overload in cells.

reperfusion injury; skeletal muscle;endothelin-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.006

项目来源：河北省科学技术研究与发展计划项目(编号：12277793) 唐山市科技局科研基金资助课题(编号：12140209A-27)

063000 河北省唐山市，河北联合大学基础医学院(刘燕、王建辉、王银环、杨秀红、张连元)；河北联合大学冀唐学院(彭海兵)

R 363

A

1002-7386(2014)11-1620-03

2013-12-22)