HPLC-荧光法测定人血浆中厄贝沙坦浓度

周霞瑾 齐惠珍 张俊贞 王明霞 常青

·药物研究·

HPLC-荧光法测定人血浆中厄贝沙坦浓度

周霞瑾 齐惠珍 张俊贞 王明霞 常青

目的建立人血浆中厄贝沙坦浓度的HPLC-荧光测定方法。方法以替米沙坦为内标，乙醚-二氯甲烷(7∶3)提取的方法处理血浆。色谱柱为Diamonsil C18，流动相为水-乙腈(57∶43)，磷酸调pH值=3.00，荧光激发波长为254 nm，发射波长为371 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为室温。进样量50 μl。结果厄贝沙坦和替米沙坦的保留时间分别为6.1 min和4.3 min，在0.05～5 μg/ml范围内厄贝沙坦检测浓度线性关系良好(r=0.9996)，最低检测浓度为0.023 μg/ml。高、中、低3种浓度(4、0.8、0.08 μg/mL)的平均相对回收率分别为(101.18±6.31)%、(102.22±5.32)%、(98.45±3.52)%，提取回收率为(78.05±6.66)%，日间、日内RSD均小于10%。样品3次冻融及在-20℃冰箱长期放置稳定性良好。结论本实验建立的方法准确、灵敏度和特异性高，可用于厄贝沙坦的药代动学和药物相互作用研究

厄贝沙坦；替米沙坦；HPLC；荧光检测法；血药浓度

厄贝沙坦为一类新型的非肽类血管紧张素Ⅱ受体AT1的拮抗药,降压效果好,不良反应少,且有保护靶器官作用,临床上广泛用于高血压的治疗[1],厄贝沙坦服用后疗效个体差异较大，临床需注意个体化给药。本文在反复比较文献的基础上，建立了人血浆中厄贝沙坦的HPLC-荧光检测法，该法准确、灵敏度和特异性高，杂峰干扰少，可用于厄贝沙坦的药代动力学和药物相互作用的研究。

1 材料与仪器

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪， 474荧光检测器，515泵，Empower色谱数据工作站；SANYO低温冰箱；ZH-2涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)；800型离心机(上海分析仪器厂)。

1.2 药品与试剂 替米沙坦标准品(Lot No T-8949，美国Sigma-Aidrich公司)，厄贝沙坦标准品(批号：100607-200301，中国药品生物制品检定所)，厄贝沙坦片(赛诺菲安万特杭州制药有限公司，规格：0.15 g/片，批号：0A020)，试验用水为多效蒸馏水，乙腈为色谱纯，乙醚、二氯甲烷、磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2]色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)，流动相：水:乙腈(57:43)，用磷酸调pH值为3.00，流速：1.0 ml/min，柱温：室温；荧光检测波长：激发波长为254 nm，发射波长为371 nm[3]；内标：替米沙坦；进样量：50 μl；该色谱条件下厄贝沙坦和替米沙坦的保留时间分别为6.0 min 和4.2 min，厄贝沙坦和替米沙坦分离效果良好。空白血浆和加入内标和标准品的血浆，按血浆样品的处理方法处理后进样。空白血浆的内源性物质对药物和内标物无干扰。见图1。

图1 厄贝沙坦的高效液相色谱图

2.2 对照品溶液的配制 精密称取(避光称量)干燥至恒重的厄贝沙坦对照品，置于10 ml容量瓶中，加5 ml甲醇溶解，然后用蒸馏水定容至刻度，配成100 μg/ml储备液，置4℃冰箱避光保存。临用前用50%甲醇将厄贝沙坦储备液按适当比例稀释，制成浓度为10 μg/ml的厄贝沙坦对照品溶液。

2.3 内标溶液的配制[4]精密称取干燥至恒重的替米沙坦对照品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解，配成浓度为100 μg/ml的内标储备液，于4℃冰箱保存。临用时取0.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释，得5 μg/ml的内标溶液。

2.4 血浆样品的处理[2]分别精密量取替米沙坦内标溶液40 μl和人血浆400 μl，置于10 ml玻璃离心管中，涡旋混匀，加磷酸溶液(1 mol/L)100 μl，涡旋20 s，使其酸化，然后加乙醚-二氯甲烷(7∶3)[5]混合液5 ml，涡旋振荡5 min提取，离心(1 500 r/min)5 min，取有机层5 ml于洁净干燥具塞玻璃离心管中，加NaOH溶液(0.05 mol/L) 200 μl，涡旋震荡3 min，离心(1 500 r/min)5 min，然后置于-80℃低温冰箱中冷冻15 min，弃去上层有机相，待下层融化后，取150 μl于1 ml的Ephendroff管中，加磷酸溶液(0.2 mol/L)100 μl酸化，涡旋30 s，进样50 μl分析。

2.5 标准曲线的制备 用人的空白血浆将100 μg/ml的厄贝沙坦储备液配制成5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/ml的系列标准曲线工作液。精密量取替米沙坦内标溶液(5 μg/ml)40 μl置于10 ml具塞玻璃离心管中，分别加入400 μl上述系列浓度的标准工作液，按2.4项下进行血浆样品处理，用HPLC-荧光检测法测定，将厄贝沙坦峰面积与内标峰面积的比值记为Y，厄贝沙坦浓度为X，Y对X进行线性回归，得回归方程：Y=0.0032+0.192X(r=0.9996)，结果表明：在0.05～5 μg/ml浓度范围内，厄贝沙坦峰面积与内标峰面积的比值，与血浆中厄贝沙坦浓度呈良好的线性关系，厄贝沙坦的最低检测限为0.023 μg/ml(日内RSD为3.21%，日间RSD为4.37%，n=5)。

2.6 精密度试验 取空白血浆400 μl，按2.5项下方法分别配制浓度为4 000、800、80 ng/ml的高、中、低质控血浆样品 ，每一浓度5份，按上述血浆样品处理方法处理，并测定各样品的浓度，计算日内RSD；连续测定5 d，计算日间RSD。见表1。

2.7 回收率试验 取空白血浆400 μl，按2.5项下方法，分别配制浓度为4 000、800、80 ng/ml的高、中、低3种质控血浆样品，每一浓度5份，按上述血浆样品处理方法处理，用HPLC-荧光检测法测定。计算提取回收率和相对回收率，血浆样品中厄贝沙坦峰面积与相同浓度标准对照品溶液峰面积的比值，为提取回收率；厄贝沙坦峰面积与替米沙坦内标峰面积比值记为f，将f代入当日标准曲线求算血药浓度，计算浓度与其真实浓度的比值，即为相对回收率。见表1。

表1精密度及回收率实验结果

浓度(μg/ml)日间RSD(%)日内RSD(%)提取回收率(%)方法回收率(%)44.214.3578.0±6.7101.2±6.30.80.944.4485.5±6.7102.2±5.30.087.286.4870.0±2.498.4±3.5

2.8 稳定性考察试验 取空白血浆400 μl，按2.5项下方法分别配制浓度为4 000、800、80 ng/ml的高、中、低3种质控血浆样品。将质控血浆样品分别反复冻融3次、置于-20℃冰箱中冷冻30 d和将血浆样品处理后放置24 h，进行稳定性考察。用测定值与理论值进行比较，计算相对误差。反复冻融3次、于-20℃冰箱冷冻30 d和血浆样品处理后放置24 h的RSD分别为5.93%～9.84%、1.62%～7.43%和4.27%～6.37%。表明血浆样品经反复冻融、放置均稳定。每种稳定性分别考察高、中、低3种质控血浆样品5份。

3 讨论

提取、固相萃取和蛋白沉淀的样品处理方法有文献报道[6，7]。固相萃取法操作繁琐而且成本较高。沉淀法虽然简单，但灵敏度只有0.1 μg/ml，难以满足厄贝沙坦的药动学研究。本实验选择提取法。在提取法中， 我们分别考察了提取后冷冻和提取后挥干2种方法，其中提取后挥干法损失较冷冻法小，但是由于流动相对挥干后残留物的复溶程度不佳，故测定值不稳定，后又改用磷酸(0.2 mol/L)复溶，结果并未改善；本试验采用比例为7∶3的乙醚和二氯甲烷有机溶液提取，后再用氢氧化钠反提，然后冷冻、弃去有机相、酸化水相，浓缩和纯化了样品。并且冷冻后有机相位于上层，易于操作。本试验建立的测定方法回收率高、灵敏度和特异性均较高，可用于厄贝沙坦的药代动力学和药物相互作用研究，为临床个体化用药提供技术支持。

1 Waeber B.A review of irbesartan in antihypertensive therapy: comparison with other antihypertensive agents.Current Therapeutic Research,2001,62:505-521.

2 周霞瑾，齐惠珍，牛哲哲，等.辛伐他汀对厄贝沙坦药代动力学影响的研究.中国药理学通报，2012,28：701-704.

3 Gonzalez L,Lopez JA,Alonso RM,et al.Fast screening method for the determination of angiotensin receptor antagonists in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection.J Chromatogr A,2002,949:49-60.

4 王明霞，侯娟，王敏，等.HPLC-荧光检测法测定人血浆中替米沙坦的浓度的方法改进.中国药房， 2007，18：1556-1557.

5 Shakya AK,Al-Hiari YM，Alhamami OM.Liquid chromatographic determination of irbesartan in human plasma.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,848:245.

6 王婉刚，刘启明.HPLC-荧光检测法测定人血浆中厄贝沙坦的浓度.中国药房， 2007，18：2512-2513.

7 陈永玲，朱家壁，丁义华.HPLC法测定家兔血浆中厄贝沙坦的浓度.江苏药学与临床研究， 2006,14：153-155.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.058

项目来源：河北省医学科学研究重点课题计划(编号：20100443)

050011 石家庄市，河北医科大学第四医院药剂科(周霞瑾、齐惠珍、张俊贞、王明霞)；河北医科大学药学院(常青)

王明霞，050011 河北医科大学第四医院；

E-mail:mxia_wang@yahoo.com.cn

R 917

A

1002-7386(2014)11-1733-02

2014-01-11)