人卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶活性与卵巢反应性及胚胎质量的关系

赵志明，崔 娜，郝桂敏，徐素欣(河北医科大学第二医院生殖医学中心，河北 石家庄 050000)

·论著·

人卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶活性与卵巢反应性及胚胎质量的关系

赵志明，崔 娜，郝桂敏，徐素欣
(河北医科大学第二医院生殖医学中心，河北 石家庄 050000)

目的探讨体外受精-胚胎移植中人卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶的活性与相应卵巢反应性和胚胎质量的关系。方法收集56例行体外受精-胚胎移植患者卵泡液中的黄素化颗粒细胞，并进行体外培养；根据卵泡数不同分为低反应组、中反应组和高反应组；又根据优质胚胎率不同分为低质量组和高质量组。端粒重复序列扩增酶联免疫吸附分析法测定颗粒细胞端粒酶活性，并比较低反应组、中反应组与高反应组以及低质量组与高质量组颗粒细胞端粒酶的活性。结果分离提纯的人黄素化颗粒细胞于24h内贴壁生长良好。随着患者的年龄、使用促性腺激素量的增加，端粒酶活性ΔA值逐渐降低，随着获卵数的增加端粒酶活性ΔA值逐渐上升，即端粒酶活性与年龄、促性腺激素量呈负相关，端粒酶活性与获卵数呈正相关(P<0.05)；低反应组与中反应组和高反应组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。随着优质胚胎率的升高，颗粒细胞端粒酶活性也逐渐升高，二者呈正相关(P<0.01)；胚胎高质量组与低质量组颗粒细胞端粒酶活性差异有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的人卵巢黄素化颗粒细胞存在端粒酶活性的表达。黄素化颗粒细胞端粒酶活性降低与卵巢功能的下降可能有关，颗粒细胞的凋亡可能影响卵母细胞的发育潜能。

体外受精；胚胎移植；卵巢

卵巢颗粒细胞具有高度的增殖与分化潜能，在卵泡发育的不同阶段，颗粒细胞增殖速度不同，当卵母细胞发育成熟并接近卵泡壁时，颗粒细胞分裂能力最强[1]，对卵泡的形成和发育及卵母细胞的营养和成熟起重要作用。端粒对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用。端粒酶能延长缩短的端粒，在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用[2]。本研究通过测定体外受精(invitrofertilization，IVF)中获取的人卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶的活性，探讨其与卵巢反应性和胚胎质量的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2007年11月—2008年12月在河北医科大学第二医院生殖医学科行IVF治疗的不孕症患者56例，年龄23～37岁，平均(29.57±3.97)岁，月经周期正常，不孕原因为双侧输卵管梗阻。基础体温呈双向型，血清泌乳素水平在正常范围，受试前3个月内均未服用过激素类药物。促排卵方案采用常规长周期降调节方案[3]，阴道超声引导下穿刺取卵，记录每位患者促性腺激素(gonadotropin,Gn)使用量。分离出卵丘复合物后的卵泡液经患者夫妇同意用于科研用途。根据取卵时卵泡发育数不同进行卵巢反应性分组，卵泡直径为16mm以上的卵泡数≤4个为卵巢低反应组(简称低反应组)8例，卵泡数5～19个为卵巢中反应组(简称中反应组)38例，≥20个为卵巢高反应组(简称高反应组)10例。1、2级胚定为优质胚，优质胚率=优质胚数/形成卵裂的胚数×100%。优质胚率<60%，为胚胎质量低组(简称低质量组)30例，优质胚率≥60%，为胚胎质量高组(简称高质量组)26例。

1.2 人黄素化颗粒细胞的分离：分离出卵丘复合物后的卵泡液，经1 000r/min离心10min，弃上清。细胞沉淀物加适量PBS混匀。然后缓慢加入到45%Percoll分离液上层(按1∶1比例)，1 000r/min离心20min。吸取界面处的颗粒细胞层，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化5～10min，加入含10%胎牛血清的1640培养液中止消化，1 000r/min离心10min，弃上清，经胎盘蓝染色细胞存活率在85%～90%，将活颗粒细胞浓度调整为2×105/mL的单细胞悬液备用。整个细胞收集过程要尽快完成，避免引起颗粒细胞额外的损伤和死亡。

1.3 人黄素化颗粒细胞的培养及HE染色：采用盖玻片培养法，将部分人黄素化颗粒细胞单细胞悬液分别置于6孔板中，6孔板中已经提前放置好用0.05%L-多聚赖氨酸涂布无菌盖玻片，37℃、5%CO2培养箱培养，24h后，细胞贴壁达到80%以上，蒸馏水冲洗，苏木精染色3min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化，氨水返蓝，自来水冲洗，伊红染色1min，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。

1.4 端粒重复序列扩增酶联免疫吸附分析测定端粒酶活性：按该试剂盒所提供的操作程序进行。每反应体系取2×105个细胞加入100μL裂解液[含Tris-HCl(pH7.5)10mmol/L、MgCl21mmol/L、EGTA1mmol/L、PMSF0.1mmol/L、β-巯基乙醇50mmol/L,0.5%CHAPS、10%甘油]，4℃下裂解1～2h。然后离心(4℃，12 000r/min，15min)取上层水相，此为总mRNA。取5μL细胞提取物，加至PCR反应管中，构建50μL的反应体系(为一种含Tris缓冲液，包含有端粒酶底物、引物、Taq聚合酶、核苷酸，并有生物素标记的P1-TS上游引物和P2下游引物)。引物延伸，25℃ 30min1次；端粒酶灭活，94℃ 5min2次；扩增，变性94℃ 30s、退火，50℃ 30s、延伸，72℃ 90s，共29个循环；最后延伸，72℃ 10min1次。如此反应作用原理是先以端粒酶RNA为模板逆转录合成端粒DNA并将端粒重复序列(TTAGGG)加到带有生物素标记的上游引物末端，再用下游引物与之结合，通过PCR扩增法延伸出产物。取5μLl扩增产物，加入20μL变性试剂，25℃孵育10min，再加入225μL杂交缓冲液，振荡混匀后取100μL混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃,300r/min振荡2h，弃去杂交液，用缓冲液清洗3次；加入抗-DIG-POD工作液100μL，25℃，30min，再用缓冲液清洗5次；加入TMB底物溶液100μL，20min后再加入100μL终止液终止反应。用酶标仪测定450、690nm的吸光度(absorbance，A)值。端粒酶活性用ΔA=A450-A690表示。

2 结 果

2.1 人黄素化颗粒细胞在体外培养生长情况：分离提纯的人黄素化颗粒细胞培养显示，细胞于24h内贴壁生长良好，倒置显微镜下观察细胞，见细胞主要呈星形或椭圆形生长，细胞有细长的突起，相互连接，细胞核大、圆，胞浆饱满富含颗粒，HE染色可见细胞核呈蓝紫色，胞浆均匀呈淡粉红色，核仁清晰。

2.2 端粒酶活性的表达与卵巢反应性：高反应组、中反应组端粒酶活性较低反应组高，差异均有统计学意义(P<0.01)，而中反应组与高反应组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

GroupsnTelomeraseactivityHighrespond100．405±0．075∗Moderaterespond380．355±0．116∗Lowrespond80．160±0．043 F14．563 P<0．01

*P<0.01vslow respond group byqtest

2.3 端粒酶活性的表达与胚胎质量：胚胎高质量组端粒酶活性较低质量组高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

GroupsnTelomeraseactivityHighquality260．408±0．088Lowquality300．273±0．120t4．753P<0．01

2.4 相关性分析：随着患者的年龄、使用Gn量的增加，端粒酶活性ΔA值逐渐降低，随着获卵数的增加端粒酶活性ΔA值逐渐上升，即端粒酶活性与年龄、Gn量呈负相关(r=-0.493、-0.424，P<0.05)，与获卵数呈正相关(r=-0.491，P<0.05)。随着优质胚率的升高，颗粒细胞端粒酶活性也逐渐升高，二者呈正相关(r=-0.697，P<0.01)。

3 讨 论

3.1 端粒酶在人卵巢黄素化颗粒细胞的表达：在细胞的每次增殖分裂过程中，各种有害的结合会发生在染色体末端，一旦有害结合造成的损害达到功能基因时，细胞就会进入衰老并死亡。端粒一般存于染色体的末端，其功能不良就会使染色体断裂。而端粒酶活性对维持端粒长度至关重要，端粒酶活性降低使端粒功能不良，导致遗传信息进行传代时的不完整，进而细胞死亡[4]。本研究结果显示，体外培养的人卵巢黄素化颗粒细胞存在端粒酶活性的表达。黄素化颗粒细胞具有端粒酶活性，反映了此时颗粒细胞的增殖能力，推测黄素化颗粒细胞可能借此使端粒保持一定长度，从而保障其生理功能的正常发挥。

3.2 端粒酶活性与卵巢反应性：随着女性年龄增长其生育力下降，对评估卵巢功能的方法目前临床上包括血清基础卵泡刺激素水平、氯米芬试验、促性腺激素释放激素激动剂刺激试验、超声监测窦卵泡数等，但都只能间接反映卵巢功能。卵巢功能下降，卵巢内卵泡数目持续性减少，卵巢内主要细胞颗粒细胞功能的减弱可能是较为重要的因素。端粒酶活性的降低可能与颗粒细胞凋亡导致卵泡的闭锁加剧有关。Yamagata等[5]研究卵泡闭锁与端粒酶活性之间的关系，发现未成年大鼠皮下注射马绒毛膜促性腺激素后第2天颗粒细胞端粒酶活性明显升高，第4～5天时当较大的卵泡发生闭锁后，颗粒细胞端粒酶活性显著下降；而给予前列腺素以阻止卵泡闭锁时，颗粒细胞端粒酶活性未见明显降低。提示端粒酶活性在卵泡的生长发育过程中可能起到重要的作用，端粒酶活性缺乏可能导致卵泡的闭锁。本研究结果显示，黄素化颗粒细胞端粒酶活性与年龄、Gn量呈负相关，与获卵数呈正相关。提示端粒酶活性降低与卵巢功能的下降有关，端粒酶可能对维持卵巢功能起重要作用。随着端粒酶检测方法的定量化及敏感性、特异性的不断提高，以及通过直接检测不同年龄卵巢端粒长度，端粒、端粒酶可望成为评价卵巢功能的一项直接而敏感的指标。

3.3 端粒酶活性与胚胎质量：卵母细胞周围的颗粒细胞层被称为卵丘颗粒细胞，卵母细胞与卵丘颗粒细胞之间存在广泛的复杂连接机制，包括细胞间的缝隙连接等，对调节卵母细胞发育起着非常重要的作用[6]。卵丘颗粒细胞向卵母细胞运送其所需要的营养物质，同时激素、生长因子等多种物质也通过颗粒细胞对卵母细胞发挥作用，此外某些特定生长因子、蛋白质还可以通过卵丘颗粒细胞贮存和释放，这些生长因子、蛋白质在卵母细胞成熟及卵裂球发育过程中按一定顺序表达或选择性地弥散来发挥调节作用。另外，卵母细胞还分泌一些具有旁分泌作用的重要因子，这些因子能够促进颗粒细胞增殖、分化，并调节颗粒细胞的功能，卵母细胞与颗粒细胞之间的相互协调、相互作用，共同调节卵泡的正常发育[7]。卵母细胞的成熟、受精及后续相应胚胎的质量与其周围的颗粒细胞的凋亡之间存在着密切相关性[8]。Høst等[9]研究表明，颗粒细胞的凋亡与卵母细胞核的成熟、受精有关。本研究结果显示，优质胚率与颗粒细胞端粒酶活性有明显的相关性。颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接对卵母细胞起着重要的作用，细胞凋亡会引起组织细胞的退化、萎缩及功能低下。在卵母细胞成熟前，其处于开放状态，颗粒细胞向卵母细胞传递凋亡信息，大量分子物质从而进入卵母细胞。而当凋亡信息过强时，也就是颗粒细胞异常过强的凋亡可能影响卵母细胞质量，进而影响卵母细胞的发育潜能，影响胚胎的质量。颗粒细胞凋亡率低的卵母细胞获得的胚胎移植后妊娠率高于凋亡率高者[10]。

综上所述，卵巢颗粒细胞端粒酶表达与促排卵时卵巢反应性及胚胎质量有关，其可能通过调节颗粒细胞的增殖起作用，其表达水平可能作为一个反应卵母细胞及胚胎质量的标志物，从而对超排卵起指导作用。

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(本文编辑：赵丽洁)

RELATIONSHIPOFTELOMETASEACTIVITYOFHUMANLUTEINEDGRANULOSACELLSWITHOVARIANRESPONSEANDEMBRYOQUALITY

ZHAOZhiming,CUINa,HAOGuimin,XUSuxin
(CenterofReproductiveMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveToexploretherelationshipoftelomeraseactivityofhumanluteinedgranulosacells(GCs)withovarianresponseandembryoquality.MethodsFity-sixcasesreceivingIVF-ETwereusedtocollectthedataofGCs.TheexperimentwascarriedoutthroughthefollowingproceduresluteinedGCswereisolatedfromfolliclefluidandwerecultured24hourssoon;testsofthetelomeraseactivityofGCswithTRAP-ELISA.Comparisonsofage,numberofampulesofgonadotropin(Gn)administered,numberofretrievedoocytes,rateofhighqualityembryowithtelomeraseactivityweremadeindifferentovarianresponseandembryoqualitygroups.ResultsIsolatedandpurifiedGCswereculturedandadherencedwellin24hours.TherewerenegativecorrelationbetweentelomeraseactivityofGCswithage,numberofampulesofGnadministeredandpositivecorrelationwithnumberofretrievedoocytes(P<0.05).LowresponsegrouphadlowertelomeraseactivityinGCscomparedtomediumandhighresponsegroups(P<0.01).TherewerepositivecorrelationbetweentelomeraseactivityofGCswithratioofhighembryoquality(P<0.01).TherewassignificantdifferenceoftelomeraseactivityofGCsindifferentembryoqualitygroups(P<0.01).ConclusionTelomeraseactivitycouldbetestedinhumanluteinizedGCsafterinvitroculture.ItmaysuggestthattelomeraseactivitydecreasedwiththedeclineinovarianfunctionandtheapoptosisofGCsmaydirectlyaffectoocytedevelopmentalpotential.

fertilizationinvitro;embryotransfer;ovary

2014-02-22；

2014-05-29

河北省科技厅科技支撑计划(10276105D-88)；河北医科大学第二医院基金项目(2h1200728)

赵志明(1973-)，女，河北饶阳人，河北医科大学第医院副主任医师、副教授，医学博士，从事人类辅助生殖技术研究。

R321-33

A

1007-3205(2014)06-0621-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.001