重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对类风湿关节炎患者外周血Fas系统的影响

夏晨辉，吴晓岩，彭晨星，魏伟华，韩玉祥，靳洪涛，郭惠芳(.哈励逊国际和平医院药学部，河北 衡水 05000；.河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000；.河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北 石家庄 050000；.河北省任丘市人民医院内科，河北 任丘 06550)

·论著·

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对类风湿关节炎患者外周血Fas系统的影响

夏晨辉1，吴晓岩2，彭晨星3*，魏伟华4，韩玉祥3，靳洪涛3，郭惠芳3
(1.哈励逊国际和平医院药学部，河北 衡水 053000；2.河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000；3.河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北 石家庄 050000；4.河北省任丘市人民医院内科，河北 任丘 062550)

目的通过检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者在应用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein，rhTNFR∶Fc)治疗前后外周血T淋巴细胞Fas/Fas L水平的变化情况，了解rhTNFR∶Fc对RA患者外周血T淋巴细胞凋亡的影响。方法RA患者64例为治疗组，并随机分为3个亚组，甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)组17例，rhTNFR∶Fc组25例，MTX+rhTNFR∶Fc治疗组22例；并选择正常体检者18例作为对照组。各组分别抽取rhTNFR∶Fc治疗前后静脉血检测Fas/Fas L的水平，记录所有RA患者28个关节的关节压痛数、关节肿胀数，检测红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR，魏氏法)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF-IgM，比浊法)，并计算28个关节疾病活动指数(disease activity score 28,DAS28)。结果各组RA患者治疗前外周血中关节压痛数、关节肿胀数、ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L、Fas/Fas L水平均比正常对照组明显增高，治疗后各指标均明显下降，其中MTX+rhTNFR∶Fc组较其余2组更为显著(P<0.01)。RA患者在接受rhTNFR∶Fc治疗后，Fas/Fas L与ESR、RF、DAS28呈正相关(r=0.441、0.527、0.466，P<0.01)。结论rhTNFR∶Fc可以通过抑制活化的T淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子α，下调RA外周血淋巴细胞Fas系统的表达，最终达到抗风湿的作用。

关节炎，类风湿；受体，肿瘤坏死因子，Ⅱ型；T淋巴细胞

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以持续的滑膜炎、多关节骨与软骨破坏为特征的系统性自身免疫性疾病。外周血T淋巴细胞的凋亡在RA发病机制中占有非常重要的地位[1]。细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，Fas系统是引起细胞凋亡的主要途径之一。Fas属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族成员，广泛分布于活化的T、B淋巴细胞，某些上皮细胞和肿瘤细胞中也有表达。Fas L是Fas在人体内的天然配体,Fas和Fas L相互作用是诱导细胞凋亡的重要途径，当Fas与Fas L结合时，将信号传递到胞质区，致Fas的死亡域结构活化，介导表达Fas的细胞凋亡[2]。注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein，rhTNFR∶Fc)可竞争性地与血中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)结合，阻断其与细胞表面TNF-α受体结合，降低其活性，是治疗RA的新一代改善病情药物。本研究拟通过检测RA患者在应用rhTNFR∶Fc治疗前后外周血T淋巴细胞Fas/Fas L水平的变化情况，了解rhTNFR∶Fc对RA患者外周血T淋巴细胞凋亡的影响，探讨其治疗RA的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2012年1月—2013年11月在河北医科大学第二医院确诊的RA患者64例为治疗组，均符合美国风湿病协会1987年修订的RA诊断标准，男性16例，女性48例；年龄19～53岁，平均(35.2±10.5)岁；病程1.2～8.7年，平均(3.5±1.3)年。并选择体检中心体检的健康志愿者18例为对照组，男性6例，女性12例；年龄20～51岁，平均(32.6±7.4)岁；需询问病史、体格和常规生化检查、心电图和正位胸部X线片等辅助检查，无器质性疾病，而且既往无RA及其他自身免疫性疾病。2组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。治疗组随机分为3个亚组，甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)组17例，rhTNFR∶Fc组25例，MTX+rhTNFR∶Fc组22例。研究符合医院人体试验伦理委员会所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。MTX组口服MTX10mg/次，每周1次，共用12周；rhTNFR∶Fc组皮下注射rhTNFR∶Fc 25mg/次，每周2次，共用12周；MTX+rhTNFR∶Fc组为上述2种药物联合应用，剂量同上，共用12周。

1.2 试剂与仪器：注射用rhTNFR∶Fc(商品名益赛普，批准文号S20050058，12.5mg/支)购于上海中信国建制药有限公司，注射用MTX(10mg/支)购于上海华联制药有限公司，PE-Fas及PE-Fas L购于美国CALTAG公司，FITC-IgG1及PE-Ig G2α购于美国Pharmigen公司，RF试剂盒均购于欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司，细胞培养箱(美国Forma公司，TNZ1FORMA3111)，流式细胞仪(美国BD公司，FACS Calibur)。

1.3 方法：收集所有受试者肝素抗凝静脉血0.5～1.0mL。在流式专用试管内加入抗Fas单抗-PE、抗Fas L单抗-PE及同型对照IgG2a PE各10μL，然后加入50μL抗凝全血混匀，室温避光反应20min。加入溶血素溶血500μL，涡旋混匀，室温避光12min，反应完毕后用PBS洗涤1次，加PBS 3mL。离心机1 000r/min离心5min，弃上清液，留沉淀上机检测。以Cellquest软件进行样本的摄取及分析，共记录10 000个细胞。圈定淋巴细胞群进行Fas及Fas L分析。结果以双参数散点图(dot plot)显示，由流式细胞仪附带软件处理给出结果。

1.4 观察指标：分别抽取RA患者rhTNFR∶Fc治疗前后静脉血检测Fas/Fas L的水平，记录RA患者28个关节(28个关节包括腕、肘、肩、膝关节各2个，双手近指关节及掌指关节各10个)的关节压痛数、关节肿胀数，检测红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR，魏氏法)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF-IgM，比浊法)，并计算28个关节疾病活动指数(disease activity score 28,DAS28)。DAS28包括人体28个关节的压痛计数、肿胀计数、ESR的水平以及患者的自身综合评估(最近7d患者RA病情活动性，用0～100mm表示，数值越大，活动性越大)。DAS28=0.56×SQRT(T28)+0.28×SQRT(SW28)+0.70×LN(ESR)+0.014×GH。

2 结 果

2.1 脱落病例和不良反应：治疗组共完成试验59例，脱落5例，其中MTX组2例，rhTNFR∶Fc组1例，MTX+rhTNFR∶Fc组2例。共发生不良事件4例，无严重不良事件发生，其中MTX组2例[1例为白细胞减低(3.31×109/L)，1例为肝功能损伤(丙氨酸转氨酶62U/L，天冬氨酸转氨酶56U/L)]，rhTNFR∶Fc组1例为皮肤注射处红肿，MTX+rhTNFR∶Fc组1例为白细胞减低(3.2×109/L)。各组不良反应均未影响本试验研究。

2.2 4组观察指标比较：3个亚组患者治疗前关节压痛数和关节肿胀数差异无统计学意义，治疗后MTX+rhTNFR∶Fc组关节压痛数明显少于MTX组和rhTNFR∶Fc组(P<0.05)；关节肿胀数rhTNFR∶Fc组少于MTX组(P<0.05)，MTX+rhTNFR∶Fc组少于rhTNFR∶Fc组(P<0.01)；治疗前3个亚组ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L和Fas/Fas L均高于对照组(P<0.05)，而3个亚组之间差异无统计学意义，治疗后3个亚组ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L和Fas/Fas L较治疗前均明显降低(P<0.05)；3个亚组各指标较正常对照组有升有降，但最接近正常对照组的是MTX+rhTNFR∶Fc组组，其次和rhTNFR∶Fc组。见表1。

2.3 相关分析：RA患者在接受rhTNFR∶Fc治疗后，Fas/Fas L与ESR、RF、DAS28呈正相关，差异有统计学意义(r=0.441、0.527、0.466，P<0.01)。

组别例数关节压痛数(个)治疗前治疗后关节肿胀数(个)治疗前治疗后正常对照组180000MTX组159．67±2．155．37±1．94☆6．13±1．543．96±1．45☆rhTNFR∶Fc组249．17±2．415．19±2．04☆5．42±1．583．18±1．57#☆MTX+rhTNFR∶Fc组209．65±2．513．68±2．17#△☆5．85±1．352．19±1．26△☆ F值0．2993．9161．1134．452 P值0．7420．0260．3360．016组别例数ESR(mm/1h)治疗前治疗后RF(kU/L)治疗前治疗后正常对照组187．56±3．737．56±3．734．32±2．294．32±2．29MTX组1554．87±13．34∗22．54±15．97∗☆245．81±82．14∗131．27±63．52∗☆rhTNFR∶Fc组2449．12±12．69∗22．78±17．83∗☆276．43±93．55∗124．58±72．49∗☆MTX+rhTNFR∶Fc组2052．62±12．17∗15．82±11．16☆235．12±85．67∗76．62±59．57∗#△☆ F值71．8025．42549．44118．464 P值0．0000．0020．0000．000组别例数DAS28治疗前治疗后Fas(%)治疗前治疗后正常对照组181．41±1．331．41±1．3319．35±5．2619．35±5．26MTX组156．24±2．26∗3．31±1．43∗☆54．38±7．86∗4．32±8．54∗☆rhTNFR∶Fc组245．63±1．94∗3．46±1．37∗☆51．47±8．29∗23．63±7．47∗☆MTX+rhTNFR∶Fc组205．76±2．25∗2．05±1．06∗#△☆53．52±8．62∗16．58±8．11#△☆ F值23．35812．1687．8185．254 P值0．0000．0000．0000．002组别例数FasL(%)治疗前治疗后Fas/FasL治疗前治疗后正常对照组181．53±0．661．53±0．6612．26±3．4712．26±3．47MTX组153．45±0．78∗1．88±0．64☆22．78±2．96∗13．63±2．57∗☆rhTNFR∶Fc组243．74±0．85∗1．92±0．73☆24．48±3．38∗14．21±3．13∗☆MTX+rhTNFR∶Fc组203．66±0．74∗1．35±0．67△☆24．52±3．24∗9．58±2．06∗#△☆ F值35．2123．31960．21616．633 P值0．0000．0240．0000．000

*P<0.01与正常对照组比较 #P<0.05与MTX组比较 △P<0.05与rhTNFR∶Fc组比较 ☆P<0.05与治疗前比较(q检验或配对t检验)
MTX：methotrexate；rhTNFR∶Fc：recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein；ESR：erythrocyte sedimentation rate；RF：rheumatoid factor；DAS28：disease activity score 28

3 讨 论

抗原通过抗原提呈细胞激活T细胞，致炎性细胞因子等炎症介质产生增多，进而引起滑膜炎、血管炎、软骨及骨破坏等RA的特征性病理变化。淋巴细胞凋亡在RA发病过程中的变化有助于进一步明确其发病机制[3]。随着RA生物技术的进展和对发病机制的研究，出现了生物慢作用抗风湿药，生物制剂可以抑制促炎因子，在炎症过程中发挥关键作用。TNF-α抑制剂在改善临床疗效及生活质量、实现RA的低疾病活动度和目标治疗方面有着非常突出的优势[4-5]。

本研究结果显示，rhTNFR∶Fc能够下调外周血淋巴细胞Fas、Fas L水平，并且与MTX作用相当，二者联用可以增加其调控Fas系统的作用，同时也明显改善关节肿胀及压痛数、ESR、RF、DAS28等炎症指标的水平，缓解RA的临床症状。

Fas系统可以诱导机体免疫细胞凋亡，是一种主动的、生理的细胞死亡方式，是机体清除活化的淋巴细胞，保证细胞群体数量稳态、维持免疫系统功能的重要手段。RA患者外周血淋巴细胞活化后可以产生多种炎症因子如TNF-α、白细胞介素4等，刺激滑膜产生炎症，生成滑膜血管翳，是造成关节破坏、畸形及功能障碍的病理基础。Chou等[6]发现在RA患者中Fas/Fas L的水平较骨关节炎患者明显升高。Cha等[7]和García等[8]研究表明，滑膜细胞凋亡障碍可以导致滑膜细胞增殖和凋亡间平衡失调，引起RA关节滑膜组织过度增生，进而导致受累关节炎症、功能减退及畸形。Fas系统对RA发病的影响以及给予慢作用抗风湿药后可以改善其对RA的诱导[9-10]。

TNF-α是RA、银屑病、强直性脊柱炎等病理过程中的一个主要炎性介质，其参与调控的炎症反应可导致关节的病理改变。rhTNFR∶Fc是新一代的生物制剂抗风湿药物，随着近年来的广泛应用，对其影响细胞凋亡方面也有许多研究。Gorak-Stolinska等[11]证实，rhTNFR∶Fc可以抑制Fas介导的细胞凋亡，从而增加人原效应T细胞易感性并进一步活化诱导细胞死亡，而且Th1和Tc1的细胞比Th2细胞更易发生死亡，其机制可能是抑制了参与炎症介质分泌的一种端粒酶。Fries等[12]研究rhTNFR∶Fc对实验性结肠炎小鼠肠黏膜上皮细胞凋亡的早期影响，发现rhTNFR∶Fc可以抑制回肠黏膜上皮Fas L的表达，而抗凋亡蛋白Bcl-2水平则在疾病早期即出现快速升高，证实其可能通过抑制外周循环TNF-α水平来达到抑制凋亡的作用。Mazzon等[13]评估TNF-α对TNF-α受体1基因敲除小鼠炎性疾病的发病机制时发现，TNF-αR1KO小鼠显著减少炎症部位渗出液的积聚和炎症细胞的数量，同时Fas L也显著降低，并且对炎症小鼠注射rhTNFR∶Fc后同样达到降低Fas L、抑制细胞凋亡的作用。总之，rhTNFR∶Fc可以通过抑制活化的T淋巴细胞分泌TNF-α，通过某种调控来下调RA外周血淋巴细胞Fas系统的表达，最终达到抗风湿的作用。

近期的研究[14]表明，rhTNFR∶Fc不管是单用还是与MTX联用，都非常安全和有效，随着对其作用机制的进一步明确，必将在RA治疗中得到更好的应用。

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(本文编辑：赵丽洁)

2014-03-12；

2014-04-11

河北省卫生厅医学重点科研计划(20110356)

夏晨辉(1972-)，女，河北景县人，衡水市哈励逊国际和平医院主管药师，理学学士，从事临床药理学研究。

*通讯作者。E-mail：peng2307@126.com

R593.22

B

1007-3205(2014)06-0706-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.031