广东乳源县大桥镇野生大豆自然居群遗传结构分析

赵青松，赵云云，马启彬，年海，杨存义

(1亚热带农业生物资源保护和利用国家重点实验室/国家大豆改良中心广东分中心/华南农业大学农学院，广东广州 510642;2河北农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄 050031)

广东乳源县大桥镇野生大豆自然居群遗传结构分析

赵青松1，2，赵云云1，马启彬1，年海1，杨存义1

(1亚热带农业生物资源保护和利用国家重点实验室/国家大豆改良中心广东分中心/华南农业大学农学院，广东广州 510642;2河北农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄 050031)

【目的】粤北山区的野生大豆是全世界分布最南端的野生大豆自然居群，本研究对来源于广东乳源县大桥镇的一个自然居群的遗传多样性进行分析，为该自然居群的原位保护和异位保护提供理论依据.【方法】在广东乳源县大桥镇发现的1个野生大豆自然居群中根据地形等距离采集了98株野生大豆样本，分别用22和73对微卫星(SSR)引物对其遗传结构进行了分析.【结果和结论】在98个样品中分别检测到27和85个等位变异，平均位点等位变异数分别为1.23和1.02个，居群期望杂合度(He)平均为0.02.聚类结果表明，可将居群分为3个部分，沿坪乳公路两侧分布的野生大豆表现出相对较高的遗传多样性.综合各指标表明，广东乳源县大桥镇居群的遗传多样性较低，在保护和利用时选取部分单株即可代表该群体;在对居群遗传多样性初步评价时，用均匀分布的30对引物即可.

野生大豆;遗传多样性;自然居群;SSR标记;广东乳源县

一年生野生大豆Glycine sojaSieb.et Zucc.是栽培大豆的近缘祖先种，比栽培大豆的遗传多样性高［1-2］.野生大豆群体中所蕴含的优良基因为栽培大豆改良提供了重要的基因资源，目前已从野生大豆群体中筛选出高异黄酮［3］、抗旱［4］、抗大豆花叶病毒［5］、抗大豆包囊线虫［6］、抗锈［7］、耐盐［8］、高蛋白［9］、油分特异［10］等珍贵种质，并成功利用野生大豆资源改良大豆［11］.野生大豆资源是宝贵财富，但由于人口激增、人类活动和生态环境变化等多种原因，导致野生大豆的分布面积正在逐渐减小，生境碎片化乃至消失［12］.野生大豆的保护迫在眉睫，了解群体的遗传结构是制定合理的取样策略、确定原地保存或异地保存的前提.

野生大豆主要分布在中国、日本、朝鲜半岛和俄罗斯远东地区，我国境内除青海、新疆及海南3省外，北起53°N的黑龙江省塔河县，南至24°N的广西象州均有分布［13］.然而各省所搜集和研究的野生大豆数量差异很大，编目入国家长期库保存的8 515余份野生大豆资源，南方各省所占比例不到8%，其中来自广东省的仅有16份［14］.盖钧镒等［15］对全国栽培大豆不同地理、季节生态类型和一年生野生大豆不同地理生态类型大量材料的等位酶、细胞器、DNA、RFLP等不受人工选择直接影响的中性性状分析发现，南方原始野生大豆可能是各地栽培大豆的共同祖先，南方原始栽培类型在向北方扩展过程中不断演化出各种早熟类型.董英山等［16］根据《中国野生大豆资源目录》中记载的13个性状数据分析了6 172份野生大豆资源遗传多样性、综合变异系数和地理分布，认为东南沿海是中国3个野生大豆起源中心之一.Wen等［17］调查了196个来自中国的野生大豆的8个形态性状和60个SSR位点的变异发现，华南野生大豆多样性最高.因此有必要对南方野生大豆做深入调查，为野生大豆资源保护和利用提供依据.

全国大豆考查组于20世纪80年代对全国野生大豆进行了考察，认为全国野生大豆分布的南端在广东和广西.对广东省野生大豆的表型性状已有描述［18］，从分子水平上进行遗传多样性的分析散布在全国群体的分析中，例如徐立恒等［19］分析了来自全国8个群体时发现，广东英德一个野生大豆居群具有较高的遗传多样性.本研究在对广东省乳源县大桥镇的一个野生大豆的植物学性状和生境进行调查的基础上，收集了98份野生大豆的叶子，采用SSR分子标记分析其遗传多样性，旨在更加全面地了解广东野生大豆遗传多样性，为广东省野生大豆的保护和利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

在广东乳源县大桥镇坪乳公路边发现一个野生大豆自然居群，在野生大豆居群中采集98份材料的叶子，将叶子装入自封袋内，放到随身携带的冰盒内，带回实验室置于-80℃冰箱中备用.取样方法采用居群内随机取样，根据各居群内野生大豆的分布密度不同，取样点间距五至几十米不等(图1).

1.2 SSR引物

参照Cregan等［20］建立的大豆分子标记连锁图，从每个连锁群上等距离选择3～4个SSR位点，其引物序列来源于美国农业部大豆基因组数据库(http：∥129.186.26.94/SSR.html)，共计73对引物(表1).引物由上海生物技术有限公司合成.

1.3 DNA提取

取野生大豆叶片约4 cm2放入2 mL离心管中，加入800 μL微量抽提液，用打样机打碎.65℃水浴30 min;加氯仿+异戊醇+乙醇(体积比为76∶4∶20)的混合液800 μL，摇10 min;12 000 r/min离心5 min.取上清液，加1/10体积的3 mol/L乙酸钠(约80 μL)，再加等体积(约800 μL)的异丙醇，摇3～5 min.12 000 r/min离心5 min，去上清液，加φ为75%乙醇溶液500 μL洗DNA沉淀2次，风干.加100 μL 1×TE(含RNaseA)溶解，放-20℃冰箱内保存.

1.4 PCR扩增及检测

PCR反应体系：2.0 μL的10×PCR Buffer(含Mg2+)，0.2 μL的dNTP(10 mmol/L)，0.2 μL的Taq酶(5 U/μL)，1 μL模板DNA(约50 ng)，0.12 μL的SSR Primer(50 μmol/L)，双蒸水补至20 μL.PCR反应程序为：95℃预变性5 min;94℃30 s，50℃30 s，72℃25 s，30个循环;72℃延伸5 min.反应结束后，扩增产物中加入5 μL上样缓冲液，60 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后记录条带.

图1 广东乳源野生大豆采样分布图Fig.1 The distribution of samples of wild soybean in Ruyuan County of Guangdong Province

表1 本试验所采用的SSR引物Tab.1 The list of SSR primers used in this experiment

1.5 数据统计分析

根据每个SSR标记的等位变异有无进行赋值，有带记为l，无带记为 0;并将0、1矩阵转化为基因型数据：纯合个体用2个相同的字母表示，如AA、ZZ等，杂合个体用2个不同的字母表示，如用AZ表示.等位基因数、期望杂合度、实测杂合度、有效等位变异数、Shannon指数(I)用Peakall等［21］编写的Gene-AlEx 6.5计算，用NTSYSC2.1软件进行聚类分析.

2 结果与分析

2.1 野生大豆地理分布、生境及生物学特性描述

广东省乳源县野生大豆主要分布在大桥镇附近坪乳公路的两侧，分布范围大约2万m2，不连续分布，总体呈长方形.公路的东侧主要为稻田，野生大豆主要着生在田埂、水沟旁等地方.坪乳公路西侧有一条机耕小路，野生大豆主要着生在这两条路旁边及周围.野生大豆多与主干明显的植物伴生在一起，也有一些野生大豆匍匐于地面，但长势较弱;多分布在水源充足的地方，干旱地方较少分布，近水源野生大豆植株高大，叶片肥厚，干旱地方野生大豆植株矮小.从表型性状看，野生大豆叶片的形状有卵圆形、椭圆形、披针形等，有同株异形叶现象，叶的大小差异很大，花较小，紫色或淡紫色，茎为青色或淡紫色，茎上多披绒毛，茎的形状方形或圆形.

2.2 基于22对引物遗传多样性分析

首先利用分布在20个大豆连锁群上的22对SSR引物对乳源大桥镇自然群体取得的样本进行分析，结果见表2和表3.发现在5个位点上出现多态性，多态性位点为22.73%，等位基因在居群中的分布频率不均(表2).22对引物共扩增出27条带，平均每个位点扩增出1.23个位点，大部分引物扩增出1条带，因此多样性指标均比较低(表3)，说明乳源野生大豆居群的遗传多样性较为单一.

2.3 基于22对引物的聚类分析

首先根据每对引物扩增出的带型将所有个体分为9组，每组内个体在22对SSR引物扩增产物带型一致(表4).然后从每组中选1个个体作为代表进行聚类，聚类结果见图2.在相似系数为约为0.8处可将野生大豆分为3类：第1类以RY001、RY073、RY074、RY049为代表，包括84个材料;第2类包括RY033和RY038共2份材料;第3类以RY005、RY027、RY079为代表，包括12份材料.从分布空间上看，第1类主要分布于田间地头，后2类主要分布于乳坪公路两侧.

表2 多态性位点等位基因分布频率Tab.2 Frequency of alleles of polymorphism loci

表3 各SSR位点主要遗传多样性Tab.3 The genetic diversity at SSR loci

2.4 基于73对引物对乳源野生大豆遗传多样性的分析

为了了解更多位点的遗传结构，从20个连锁群上均匀选择73对SSR引物进一步分析该群体的遗传多样性.结果表明，平均位点多态率为16.44%，73个位点共检测到85个等位基因变异，等位基因数目范围为1～2个，其中扩增出多态性条带的有12对引物，分别为Satt045、Satt419、Satt135、Satt020、Sat_ 099、Satt530、Satt539、Satt556、Satt301、Satt073、Satt239和Satt277，而其他引物对在群体内仅扩出1条带.平均有效等位基因数为1.02，Shannon指数(I)0.04，期望杂合度为0.02.

表4 基于SSR结果的个体分组Tab.4 The merged individuals by SSR

图2 基于22对引物乳源野生大豆居群聚类图Fig.2 The cluster class diagram of wild soybean in Ruyuan

22对引物所获得的主要指标与73对引物所获得的主要指标比较发现，各指标间相似，无明显差异(表5)，说明乳源野生大豆遗传多样性比较单一，对于遗传结构单一的乳源群体，只要用22对引物即可以评价其遗传多样性水平.

表522 对和73对引物主要遗传多样性指标Tab.5 The main genetic diversity index of 22 and 73 pairs of primers

3 讨论与结论

乳源县大桥镇野生大豆自然居群分布于坪乳公路两侧的路边、土埂、水沟等水源充足的地方，这和前人描述的野生大豆生境相似［18］.调查发现该群体个体间叶片大小与生境环境密切相关，分布在水源充足的野生大豆植株高大，叶片亦较大;而分布在干旱瘠薄地方的野生大豆则叶片较小.野生大豆的叶形、花色、种子形状及颜色、种子大小、茸毛疏密程度、茸毛颜色等性状等均存在不同程度的变异.乳源大豆叶片的形状有卵圆形、椭圆形、披针形等，花较小，紫色或淡紫色，茎为青色或淡紫色，茎上多披绒毛，茎的形状方形或圆形.

中国野生大豆分布广泛，来自不同地区的野生大豆多样性呈现明显的地域性，南方群体最高，黄淮海群体次之，东北群体最低［17］.目前多样性研究多集中在全球范围［22-23］或全国范围［24］的大尺度研究，这些研究为从整体上揭示野生大豆的分化提供了证据，而小区域或单一自然居群的研究却可从微进化角度提供数据.本研究利用SSR标记对广东乳源1个野生大豆居群进行了多样性分析，73个位点检测出85个等位变异，平均每个位点有1.02个多态性带，低于江西省野生大豆(7.2个)［25］、湖南新田野生大豆居群(5.4个)［26］、吉林省龙井野生大豆保护区(4.29个)［27］.乳源野生大豆居群遗传多样性较低，推测此处野生大豆是由于人类活动从其他地方带来的少数野生大豆种子繁衍形成的群体.乳源野生大豆分为3类，结合采样点分析发现，此居群中没有差异的一类(共包括84份材料)分布在田间，而其他2类主要沿坪乳公路两侧分布.由此推断此处野生大豆居群形成时间较短，遗传多样性较低.

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【责任编辑周志红】

Genetic analysis of wild soybean papulations growing in Daqiao Town of Ruyuan County，Guangdong Province

ZHAO Qingsong1，2，ZHAO Yunyun1，MA Qibin1，NIAN Hai1，YANG Cunyi1
(1 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/ Guangdong Sub-center of National Soybean Improvement Center/College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;2 Institute of Cereal＆Oil Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050031，China)

【Objective】The natural wild soybean populations distributing in the north of Guangdong are the extreme southern limit in the world.The objective of the present study was to explore the genetic characteristics of one natural wild soybean population from Daqiao Town of Ruyuan County in Guangdong Province，providing the base forin situorex situconservation for this population.【Method】Ninety-eight wild soybean samples were collected from one natural population of wild soybean growing in Ruyuan County，Guangdong Province.In order to facilitate the selection of the natural reserve of wild soybean，genetic diversity of this population was evaluated using 22 and 73 SSR makers.【Result and conclusion】The results showed that 27 and 85 alleles were detected with an average of 1.23 and 1.02 alleles per marker respectively.Expected heterozygosity(He)was 0.02 averagely.The cluster analysis showed that the population could be divided into three subgroups.The population distributing along both sides of Pinru road showed a higher genetic diversity.The above analysis indicated that the genetic diversity ofthis population was very low.Thirty selected SSR markers may clarify the primary evaluation of genetic diversity population.

wild soybean;genetic diversity;natural population;SSR marker;Ruyuan County of Guangdong Province

S336

A

1001-411X(2014)01-0037-06

赵青松，赵云云，马启彬，等.广东乳源县大桥镇野生大豆自然居群遗传结构分析［J］.华南农业大学学报，2014，35(1)：37-42.

2013-02-21优先出版时间：2013-11-07

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.007.html

赵青松(1975—)，男，硕士，E-mail:zhaoqingsonga@163.com;通信作者:杨存义(1966—)，男，副教授，博士，E-mail:ycy@scau.edu.cn

国家自然科学基金(30771364);广东省农业科技团队项目(2011A020102010)