基于简单重复序列间扩增分子标记的金钗石斛遗传多样性研究

魏丹红 徐红

1.宁海县妇幼保健院 浙江，宁海 315600 2.上海中医药大学中药研究所

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）为兰科石斛属多年生附生草本植物，主要分布于我国台湾、海南、福建、湖南、湖北、广东、广西、贵州、云南、四川等亚热带地区[1]。金钗石斛是中药石斛的常用品种之一，为历版《中国药典》的石斛收载品种，具有益胃生津、滋阴清热、强阴益精、久服厚肠胃等功效[2-3]。近三十年来由于过度采挖利用和人为生境破坏，野生金钗石斛资源遭到严重破坏，野生居群规模锐减。为满足药用需求，近几年在金钗石斛的分布地贵州、四川、重庆等地已经开始规模性的金钗石斛人工栽培，一定程度上缓解了资源紧缺的状况。近来有学者用序列相关扩增多态性（sequence-related amplified polymor-phism，SRAP）分子标记[4]和简单重复序列间扩增（inter simple sequence repeat，ISSR）[5]技术研究金钗石斛的遗传多样性，然而研究取样仅局限于贵州地区和秦巴地区，产地缺乏代表性。ISSR技术以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术为基础，根据真核生物中广泛存在1～6个碱基的简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）的特点，对SSR之间的一段DNA序列进行扩增，检测SSR序列间的DNA序列差异。与SRAP分子标记、随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）比较，该技术检测的遗传多态性丰富，具有简单快速、重复性及稳定性高等优势，是研究药用植物遗传多样性的常用分子标记[6-7]。因此，本研究拟运用ISSR分子标记技术对我国主要产区的21个居群的152个金钗石斛样本进行分子水平的遗传多样性研究，探明其遗传多样性现状，为金钗石斛种质资源的保护和新品种选育提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 用于遗传多样性分析的金钗石斛材料包括3个野生居群和18个栽培居群，共21个居群的152个个体样本，采集于2006年4月至7月。除浙江居群外，其他金钗石斛居群样本都留有标本，现存于上海中医药大学中药研究所，各样本均经上海中医药大学中药研究所徐红博士鉴定原植物学名。金钗石斛居群样本信息见表1。

表1 金钗石斛居群样本信息Tab.1 Samples of population from D.nobile

1.2 主要试剂 Plant DNA Mini Kit试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司（批号：HS017G03）；溴代十六烷基三乙胺（cetyltrimenthyl ammonium bromide，CTAB）购于国药集团上海化学试剂公司（批号：F20070220）；分析纯乙二胺四乙酸二钠盐（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、GeneRulerTMDNA Ladder Mix和GeneRulerTM1kb DNA Ladder均购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司（批号：F20070316、12403651、13256312）。

1.3 主要仪器 PTC-200型PCR仪购于美国MJ Research公司；Image Master VDS凝胶成像分析系统为美国Pharmacia Biotech公司产品；琼脂糖凝胶电泳仪系统装置购于北京六一仪器厂；Nucleic Acid and Protein Analyzer、AvantiTM30离心机均为美国Beckman公司产品。

1.4 DNA提取 本研究采用改良的CTAB法提取DNA[8-9]，所有植株均采集上部嫩枝嫩叶进行提取，提取物-20℃保存备用。

1.5 ISSR引物及其产物检测 从加拿大哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物（University of British Columbia，Set No.801～900）和文献[10]报道的10条引物中筛选出多态性较高的、适合金钗石斛ISSR扩增的10条引物UBC811、UBC834、UBC841、UBC842、UBC873、UBC880、UBC881、No.5（（AG）8AA）、No.7（（AC）8GA）和No.9（（AG）8CC），作为选定的正式引物用于金钗石斛遗传多样性研究，以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 反应体系共10μL：DNA （约10ng）1.0μL，25mmol·L-1的MgCl20.80μL，10mmol·L-1的dNTP mix 0.20μL，10μmol·L-1引物1.0μL，5U·μL-1Taq聚合酶0.12μL。 扩增程序：94°C预变性5min；94°C 45s，51°C 45s，72°C 2min，共38个循环；72°C延伸7min[9]。

1.6 统计学分析 采用POPGENE1.32软件计算居群内及居群间的等位基因数（number of alleles，Na）、有效等位基因数（effective number of alleles，Ne）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）、香农信息指数（Shannon's information index，Im）与多态位点百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）、居群总遗传变异（total genetic diversity for species，Ht）、居群内的遗传变异 （the mean heterozygosity within population，Hs）、居群间的遗传变异（the mean heterozygosity among population，Dst）、 居群间的遗传分化系数（coefficient of gene differentiation，Gst）、 基 因 流 （gene flow，Nm）和居群间Nei无偏遗传距离[11-12]。其中Dst=Ht-Hs。用NTSYSpc 2.10软件计算样品间的Jaccard遗传相似性系数（1908），用SHAN程序对经Lynch-Milligan校正过的Nei无偏遗传距离构建居群间非加权配对算术平均法（unweighted pair group with arithmetic average，UPGMA）聚类图，并利用UPGMA聚类对全部居群样品之间的遗传关系进行分析，采用AMOVA 1.55软件进行分子方差分析，计算居群内、居群间和地区之间的变异方差分布[12-15]。

2 结果

2.1 扩增产物的多态性和遗传多样性 金钗石斛共152个样本，运用筛选出的10个引物进行PCR扩增，共扩增出292条重复性高、清晰的条带，扩增片段的长度从100～10 000bp，平均每个引物扩增出29.2条条带，多态性条带为292条，有效条带百分率为100%。扩增产物的多态性因引物而异，每个引物在每个居群中扩增出的有效条带数为6～29条。用ISSR进行PCR扩增，可以清晰、有效地分辨出不同居群个体的基因型，居群内的个体间也有一定程度基因型的分化，即每个个体都具有独立的基因型，152个个体共计152个基因型。21个居群中，以云南西双版纳勐海居群（居群编码18）和景洪大渡岗居群（居群编码17）的多样性最丰富，PPB分别为47.95%和46.58%，总条带数也最多，分别为161和170条；浙江乐清龙西居群（居群编码14）的多样性最低，PPB为9.93%，扩增的总条带数最少，为76条；其他居群介于二者之间。见表2。PPB数据表明，ISSR-PCR能够在不同产地的金钗石斛居群中检测出丰富的遗传多态性，引物UBC811对金钗石斛不同居群样本的ISSR-PCR扩增图见图1。

图1 引物UBC811对金钗石斛不同居群样本的ISSR-PCR扩增条带Fig.1 The ISSR-PCR pattern of D.nobile from different populations using primer UBC811

表2 不同ISSR引物在不同居群中扩增出的条带数Tab.2 Number of bands per prime on different populations

2.2 居群遗传多样性分析 运用POPGENE1.32软件进行遗传多样性分析，得到的遗传多样性参数见表3。可知金钗石斛在物种水平的多态位点百分率是100%，Na为2.0000，Ne为1.3863，He为0.2398，Im为0.3783。 各居群PPB为9.93%～47.95%，Im为0.0601～0.2519，基因多样性与Im结果基本相符。

表3 金钗石斛居群、物种水平遗传多样性的统计Tab.3 Summary of genetic diversity estimation at the population and the species level for D.nobile

将来自同一个采集地区的所有个体汇总成一个居群，根据Na和PPB，各居群遗传多样性大小顺序排列为：云南＞重庆＞四川＞海南＞广西＞贵州＞浙江。根据遗传水平的算术平均值，依据Na和PPB，各居群遗传变异由高到低依次为：云南＞重庆＞四川＞海南＞广西＞贵州＞浙江；依据Ne和He，各居群遗传变异由高到低依次为：云南＞重庆＞贵州＞四川＞海南＞广西＞浙江；依据Im，各居群遗传变异由高到低依次为：云南＞重庆＞四川＞贵州＞海南＞广西＞浙江。按地区进行比较，所有遗传多样性指数均表明遗传水平最高的是云南居群，最低的是浙江居群。地区间金钗石斛遗传多样性比较见表4。

从表4可见，Na与PPB对21个居群金钗石斛遗传多样性的评价结果呈现一致的趋势，各居群遗传变异由高向低的居群为18＞17＞10＞……＞21＞14，平均为28.59%；根据Im，各居群遗传变异由高向低的居群是18＞17＞10＞16＞……＞21＞14，平均为0.1482。 18个栽培居群的Im平均值为0.1469，略低于3个野生居群的平均值（0.1556）。SPSS 22.0统计软件对Im的统计分析也表明，栽培居群与野生居群的Im差异无统计学意义（P＞0.05），说明金钗石斛在栽培过程中遗传多样性基本上没有丧失。所有居群中，云南西双版纳勐海居群（居群编码18）的遗传变异水平最高，浙江乐清龙西居群（居群编码14）的遗传变异水平最低。以上数据说明金钗石斛的21个居群出现了不同程度的遗传变异，具有一定的遗传多样性。

表4 金钗石斛地区水平遗传多样性的统计Tab.4 Summary of genetic diversity estimation at the region level for D.nobile

2.3 居群的遗传结构 本研究涉及的21个金钗石斛居群按照采集地区的不同可分为7个地区，即重庆（居群编码1～4）、海南（居群编码5～8）、四川（居群编码9～13）、浙江（居群编码14）、贵州（居群编码15～16）、云南（居群编码17～19）和广西（居群编码20～21）。 为了更加清楚地了解金钗石斛居群遗传变异的空间结构，采用AMOVA 1.55软件对21个居群进行了几种不同等级的处理：（1）7个地区之间和地区之内；（2）21个居群之间和居群之内；（3）四川5个居群之间和居群之内；（4）重庆4个居群之间和居群之内；（5）海南4个居群之间和居群之内；（6）贵州2个居群之间和居群之内；（7）云南3个居群之间和居群之内；（8）广西2个居群之间和居群之内。AMOVA分析结果表明，物种水平、居群水平、地区内居群水平和地区间居群水平均在两个不同层次上出现分化。不划分地区则55.58%的遗传变异存在于21个居群间，44.42%存在于居群内。划分地区，则四川、重庆、海南和贵州的遗传变异较大部分存在居群内，云南和广西的较大部分存在居群间，其中含有3个野生居群的四川5个居群间的遗传变异最小为36.89%，居群内的遗传变异为63.11%；广西的2个居群间的遗传变异最大，为65.81%；重庆4个居群间的遗传变异为44.28%，居群内的遗传变异为55.72%；海南4个居群间的遗传变异为45.68%，居群内的遗传变异为54.32%。见表5。以21个居群为一组，Gst为0.5779，表明在总的遗传变异中有57.79%存在于居群之间，42.21%的遗传变异存在于居群内，总的遗传变异分析结果比AMOVA分析（55.58%）略高，但是结果的趋势是一致的，即居群间的变异略高于居群内。按照采集地区划分，广西2个居群Gst最高，为0.5303；贵州2个居群Gst最低，为0.3130；说明地区间的遗传变异大于地区内。见表6。

表5 金钗石斛居群的分子方差分析Tab.5 AMOVA analysis for D.nobile from different populations

2.4 居群的Nm格局 根据POPGENE1.32软件分析所得的金钗石斛21个居群的Nm格局显示，具有2个以上居群的各地区居群中，贵州2个居群的Nm最大，为0.5487；广西2个居群的Nm值最小，为0.2214，全部21个居群的Nm值的平均值为0.1826。见表6。

表6 金钗石斛居群基因分化的居群间的Gst分析Tab.6 Gst of 21 populations of D.nobile by ISSR markers

2.5 居群间的遗传距离及遗传一致性 根据POPGENE1.32软件计算出居群间Nei无偏遗传距离与遗传一致性，21个居群间遗传一致性为0.7149～0.9527，平均0.8506。其中四川的2个野生居群石棉田湾居群（居群编码10）与泸定燕子沟居群（居群编码11）遗传距离最小，为0.0485；栽培的云南景洪大渡岗居群（居群编码17）与栽培的广西靖西安德居群（居群编码20）的遗传距离最大，为0.3356。遗传一致性正好与遗传距离相反，遗传距离最小的两个居群，遗传一致性表现最大，石棉田湾居群（居群编码10）与泸定燕子沟居群 （居群编码11）之间的遗传一致性最大，为0.9527；大渡岗居群（居群编码17）与安德居群（居群编码20）之间的遗传一致性最小，为0.7149。四川5个居群的遗传一致性为0.8860～0.9527，平均为0.9182；重庆4个居群的遗传一致性为0.8862～0.9113，平均0.8990；海南4个居群的遗传一致性为0.8794～0.8891，平均0.8838。 见表7。

2.6 DNA聚类分析 用NTSYSpc 2.1软件中的SHAN程序对Nei的遗传距离进行UPGMA聚类，构建基于ISSR标记的遗传聚类图。见图2。从图中可以看出21个居群聚成3组：云南景洪大渡岗栽培居群（居群17）独自为一组；广西的2个居群靖西安德马扒栽培居群（居群20）和乐业百中栽培居群（居群21）合为一组；第3组主要由5个四川居群 （居群9～13）、4个重庆居群（居群1～4）、2个云南居群（居群18～19）与2个贵州居群（居群15～16），以及分散在各个分支的4个海南居群（居群5～8）组成，其中所有的四川居群与重庆居群各自聚集在一个大的分支上，贵州的2个居群聚在一起（居群15～16）。

图2 基于ISSR分子标记的金钗石斛居群间的遗传聚类图Fig.2 Dendrogram of D.nobile from different populations based on ISSR analysis

3 讨论

本研究采用ISSR分子标记检测了分布于全国7个省区21个金钗石斛居群的遗传多样性，结果表明金钗石斛的21个居群出现了不同程度的遗传变异，具有一定的遗传多样性。所有居群中，云南勐海勐宋栽培居群（居群18）表现出最高的遗传变异水平，表明该栽培群体有助于当地栽培金钗石斛的种质资源筛选和新品种选育。浙江乐清栽培居群（居群14）的遗传变异水平最低，而且明显低于其他20个居群，笔者分析这可能与该居群来源不详、样本数较少（2个样本）、研究数据有限，因而不能够全面反映居群遗传变异情况有关。而ISSR分子标记在其他20个居群中检测出丰富的遗传多样性，说明该标记技术可以有效地应用于金钗石斛的遗传多样性评价研究。

Nm是指基因在居群之内和居群之间的运动，也是影响居群遗传结构的重要因素之一。基因的相互交流可引起居群内遗传变异量的增加，减少居群间的分化。文献报道，当Nm＜1时遗传漂变就成为刻画种群遗传结构的主导因素，是居群遗传结构分化的主要原因[16]。全部21个金钗石斛居群的Nm值为0.1826，说明居群间交流不够，导致了金钗石斛居群间的遗传分化，这与遗传变异较大部分存在于居群间（57.79%）的分析结果是一致的。

DNA聚类分析表明，在居群水平上遗传距离聚类与地理分布有一定相关性，金钗石斛产区之间有一定的遗传分化。分布于海南的4个居群分散在不同的分支上，居群分化明显，初步分析可能与居群种质的来源与栽培的年限有关，具体有待于进一步的深入研究。

一般说来，物种遗传多样性越丰富，对环境的适应能力越大，进化潜力就越大。本文运用ISSR分子标记对金钗石斛居群遗传结构进行研究，结果表明金钗石斛居群遗传多样性较高，丰富的遗传多样性是金钗石斛在一定范围内生长分布、对环境有较好适应能力的遗传物质基础。本研究结果进一步提示，金钗石斛野生居群锐减的主要原因不在于其遗传变异方面，而是来自人为过度采挖所导致的生境破坏和退化。自然生境的片段化、破碎化的现象越来越明显，这些将成为金钗石斛居群遗传结构发生改变的主要原因。