中药鸡骨草和毛鸡骨草的HPLC指纹图谱研究

西安电子科技大学生命科学技术学院，陕西 西安 710126

中药鸡骨草和毛鸡骨草的HPLC指纹图谱研究

曾琦齐元博薛锦文王俊影聂发玉张象涵

西安电子科技大学生命科学技术学院，陕西 西安 710126

目的建立鸡骨草和毛鸡骨草两种药材的化学指纹图谱。方法采用HPLC高效液相色谱法，色谱柱Inertsil ODS-SP C18(4.6×250mm，5μm)，水-甲醇10%～100 %梯度洗脱40min，流速1.0mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm。结果分别建立了鸡骨草和毛鸡骨草的指纹图谱，显示出特征峰。结论HPLC指纹图谱中各峰分离度较好，方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，为鸡骨草和毛鸡骨草的化学有效成分的异同及替代安全性问题研究提供参考。

鸡骨草；毛鸡骨草；指纹图谱；HPLC

鸡骨草是豆科相思子属植物广州相思子 (Abrus cantoniensis Hance) 的干燥全草，是一种常用中药材[1]。具有清热解毒、利湿、活血化瘀、舒肝止痛等功效，可用于急慢性肝炎、肝硬化腹水、胆囊炎、胃痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤、乳腺炎、泌尿系统感染等病症[2]，为广东凉茶成分之一[3]，也是治疗肝炎良药“鸡骨草胶囊”的主要原料[4]。毛鸡骨草为双子叶植物药豆科植物毛相思子 (Abrus mollis Hance)的全株。具有清热解毒，祛风除湿，健胃消积的功效，用于传染性肝炎、小儿疳积；外用可治疗烧伤、烫伤、疮疖[5]。我国的鸡骨草资源十分丰富，且鸡骨草相关品种已在临床大量使用。在2010版《中华人民共和国药典》中，只有广东相思子被定为鸡骨草的基源植物，民间却一直将鸡骨草与毛鸡骨草混用。本研究分别建立了鸡骨草和毛鸡骨草的指纹图谱，为这两种药用植物在化学有效成分的异同及替代安全性问题研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SHIMADZU高效液相色谱仪(日本岛津公司，LC-20AT泵，Inertsil ODS-SP C18 4.6×250mm，5μm色谱柱，SPD-M20A检测器，LCsolution工作站)；RE-5203旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；万能粉碎机；JA2603B电子天平。

1.2 试药 鸡骨草(采自广东省梅州市)；毛鸡骨草(采自广西省贵港地区山上)。甲醇(色谱纯，Fisher Scientific公司)；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材的提取 分别取鸡骨草和毛鸡骨草两种药材的细粉末，精密称定10.0g，置于锥形瓶中，加入分析纯的甲醇60ml，浸泡5d。用分析滤纸过滤得到滤液，后旋干得到提取物备用。

2.2 药材溶液的制备 分别精密称取两种药物的提取物50mg，完全溶于色谱纯的甲醇1ml，得到50mg/ml的母液；将母液依次稀释得到浓度为5、0.5、0.05mg/ml的溶液；将所有溶液用0.22μm的滤膜过滤，得到滤液作为供试溶液。

2.3 药材浓度的选择 配置好的0.05、5 、50 mg/ml以及更浓的未定浓度的鸡骨草供试液来探索适宜药物浓度，进样量为10μl。结果显示当供试液浓度为0.05 mg/ml时，基线漂移严重，无特征峰；浓度为50 mg/ml的供试液，可以获得最大吸光度。且浓度为50mg/ml的毛鸡骨草也显示较强的吸光度，故选定浓度为50mg/ml的药物进行后续试验。

2.4 药材进样量的选择 精密吸取50mg/ml的鸡骨草8、10、15 μl注入高效液相色谱仪，结果显示8μl的进药量出现基线漂移问题；15μl的进样量产生过载现象出现平头峰；而10μl的进样量不仅能降低基线漂移，还使最大吸收峰完整。因此，选用10μl的进样量。

2.5 色谱条件的确定

2.5.1 梯度洗脱与等度洗脱的选择[6]在高效液相色谱仪的流速1.0ml/min，紫外检测波长280nm，柱温25℃，记录时间30 min不变的情况下，分别进行下列试验：①甲醇-水等度洗脱，0～20min (30%～30%), 20～30min(100%～100%)；②甲醇-水等度洗脱，0～20 min (45%～45%), 20～30 min(100%～100%)；③甲醇-水等度洗脱，0～20 min (60%～60%)，20～30 min(100%～100%)；④甲醇-水等度洗脱，0～20 min (80%～80%)，20～30 min(100%～100%)；⑤甲醇-水梯度洗脱，0～20 min(10%～100%)，20～30 min (100%～100%)。

用甲醇分别进行30%、45%、60%、80%一系列等度洗脱，结果并没有分离出理想峰值，图谱不稳定，且基线漂移问题较严重。故用等度洗脱不能很好地保证实验的稳定性和可重复性，而用梯度洗脱可以保证较好的分离度和稳定性。

2.5.2 流动相为甲醇和乙腈的选择 ①甲醇-水梯度洗脱，0～20 min(10%～100%)，20～30 min (100%～100%)；②乙腈-水梯度洗脱，0～20 min(10%～100%)，20～30 min (100%～100%)。果表明用乙腈梯度洗脱时波动性较大，而用甲醇梯度洗脱时峰形及稳定性更好，有利于分析。

2.5.3 仪器可靠性检测 ① 将1 mg/ml的醋酸泼尼松龙母液进样10μl，用60%甲醇等度洗脱20min，柱温25℃，池温40℃，泵压稳定在20MPa。② 将1mg/ml的醋酸泼尼松龙母液进样10μl，用60%甲醇等度洗脱20min，柱温40℃，池温40℃，泵压稳定在16MPa。结果在254 nm处检测吸收峰，出现稳定的单峰。而且柱温改变，只是使出峰时间有差异，并无吸光度的影响。

2.5.4 色谱条件的确定 甲醇-水梯度洗脱，0～40min (10%～100%)，40～50min(100%～100%)，流速1.0 mL/min，紫外检测波长280 nm，柱温25 ℃，记录时间50 min。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验[7]取毛鸡骨草溶液连续进样5次，记录指纹图谱比对如图1所示，计算相对峰面积和相对保留时间的RSD，结果RSD< 3%，表明仪器精密度良好。

图1 毛鸡骨草溶液连续5次进样的HPLC指纹图谱

图2 鸡骨草和毛鸡骨草的HPLC指纹图谱

2.6.2 稳定性试验 取毛鸡骨草溶液，分别在0、4、8、12、24 h内进样测定，结果RSD<3%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.6.3 重复性试验 取毛鸡骨草溶液连续进样5次，记录指纹图谱导人中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理，所得指纹图谱的相似度均>90 %，表明该方法重复性良好。

2.6.4 空白试验 吸取空白溶剂甲醇10μl进样，结果表明空白溶剂对药材指纹图谱中色谱峰的检出无干扰。

2.7 指纹图谱的建立与分析

2.7.1 图谱的获得 分别精密吸取鸡骨草和毛鸡骨草溶液10μL，按照上述色谱条件进行分析，记录色谱图，结果见图2。

2.7.2 指纹图谱的分析与相似度评价 对比指纹图谱可以发现，两种药材所含化学成分的数与量存在差异。其中鸡骨草的极性段成分突出，集中在中高极性段(如图2所示)，且主成分的相对含量突出；而毛鸡骨草的成分含量趋向均一化，不易准确分析判断其主成分。通过指纹图谱相似度计算软件对两种药材进行相似度评价，得到鸡骨草和毛鸡骨草的最大相似度为0.52。

3 结论

本实验考察了分别以0.05、5、50mg/ml及更大浓度的鸡骨草提取液进样，结果在50mg/ml的浓度时得到最大吸光度。在色谱条件摸索过程中，分别用甲醇-水的等度洗脱、甲醇-水的梯度洗脱和乙腈-水的梯度洗脱方法，对结果稳定性和分离度的综合考虑，发现甲醇-水梯度洗脱的效果最好。

通过对鸡骨草和毛鸡骨草的几种HPLC方法进行比较，表明鸡骨草和毛鸡骨草在关键部位有相同的色谱特征峰，说明两种药材存在相同的化学成分，为相互替代提供了依据。但鸡骨草的主成分较突出，而毛鸡骨草的成分更均一化，因此在药效学方面值得关注。

中药复方成分极为复杂，仅仅使用定性鉴别和指标成分的含量测定方法很难准确的判断其内在的质量，更不用说找出其中引起药效的物质基础；而对其进行指纹图谱测定，可提供多成分群的特征。本研究建立的两种药材的HPLC指纹图谱，各峰分离度较好，方法具有良好的精密度、稳定性和可重复性，为鸡骨草和毛鸡骨草的化学有效成分的异同及替代安全性问题研究提供参考。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：180．

[2]《中华本草》编委会．中华本草[M]．上海：上海科学技术出版社，1999：303．

[3]刘传明．鸡骨草的种类与鉴别[J]．时珍国医国药，2004，15(11)：767．

[4]黄荣韶，罗永明，胡彦，等．毛鸡骨草总皂苷含量测定及其动态变化研究[J]．广东农业科学，2006，42(6)：28．

[5]中国药科大学．中药辞海 [M]．北京：中国医药科技出版社，1998：1114．

[6]史海明，黄志勤，温晶晶，等．HPLC法测定鸡骨草药材中相思子碱的含量[J]．药物分析杂志，2007，27(11)：1716-1718．

[7]黄勇斌，孙毅东，李耿，等．鸡骨草药材指纹图谱研究[J]．今日药学杂志，2011，21(5)：280-282．

ResearchonHPLCFingerprintofAbrusCantoniensisandAbrusMollis

ZENG Qi,QI Yuan-bo,XUE Jin-wen,WANG Jun-ying,NIE Fa-yu,ZHANG Xiang-han

School of Life Science and Technology,Xidian University,Xi’an 710126,China

ObjectiveTo establish a HPLC fingerprint analysis method for Abrus cantoniensis and Abrus Mollis．MethodsInertsil ODS-SP column(250mm×4.6mm,5μm)was used，with gradient elution by the mobile phase consisted of water-Methanol 10-100%.The flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelength was 210 nm．ResultsThe offingerprint of A. cantoniensis and A. Mollis were established，which show some common peaks between them.ConclusionThe characteristic peaks are selected with good resolution，and the method is accurate and stable．It can be used for the study of the similarities and differences of chemical active ingredients between A. cantoniensis and A. Mollis．

Abrus cantoniensis；Abrus Mollis ;fingerprint chromatogram；HPLC

2013年陕西省自然科学基金(2013JQ4040)及西安电子科技大学新实验开发与新实验设备及实验教学改革项目的资助(项目编号：SY1247)。

曾琦(1985-)，女，讲师，博士，主要从事天然药物化学及分析化学的研究工作。E-mail：qzeng@xidian.edu.cn

R286.0

A

1007-8517(2014)14-0022-03

2014.05.26)