脂肪来源基质细胞对超长皮瓣成活比例的影响

陈晓芳, 胡守舵, 姬东硕, 黎 静

实验研究

脂肪来源基质细胞对超长皮瓣成活比例的影响

陈晓芳, 胡守舵, 姬东硕, 黎 静

目的探讨脂肪来源基质细胞对超长皮瓣成活的影响。方法利用胶原酶消化SD大鼠腹股沟区的脂肪，经过分离培养传代，将获得的大量脂肪基质细胞行DiI染色，并在SD大鼠背部形成超比例任意皮瓣模型；将DiI染色后的脂肪基质细胞注射到皮瓣下治疗，并与生理盐水治疗组作对比；观察皮瓣大体情况，计算皮瓣成活率；观察病理切片毛细血管密度，荧光显微镜检测脂肪基质细胞在皮瓣内的分布和存活状况。结果术后第10 天，皮瓣成活与坏死部分界线清楚，脂肪基质细胞组皮瓣成活率明显高于生理盐水组。脂肪基质细胞组和生理盐水组的皮瓣存活率分别为 (67.4±5.1)%和(52.5±6.5 )%，P<0.05；毛细血管密度分别为(57.1±4.7)/mm2和(28.7±2.8)/mm2，P<0.05；脂肪基质细胞注射入SD大鼠皮瓣后，脂肪基质细胞存活并参与新生血管的形成。结论脂肪基质细胞可明显增加超比例任意皮瓣成活面积，其在临床治疗中有潜在的应用和研究价值。

脂肪基质细胞； 超长皮瓣； 大鼠

皮瓣修复术是整形外科基本技术的一种，任意皮瓣因没有知名血管，皮瓣面积受到很大限制，主要是长宽比例受限，一般为1.0∶1.0～1.0∶1.5。皮瓣移植是修复组织缺损、重建功能的重要措施之一，提高皮瓣的成活率仍是目前临床工作需要解决的问题。因此，寻找有效的方法，预防术后皮瓣的缺血坏死，具有重要的临床意义[1]。脂肪来源基质细胞以其大量存在、容易取得、不存在免疫排斥等优点而备受关注。自2013年1～12月，笔者从SD大鼠腹股沟区获得脂肪，并经分离培养，获得脂肪基质细胞，观察脂肪基质细胞能否促进血管重建，增加血管的密度，是否能够促进皮瓣的存活，从而发挥细胞治疗的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

250～300 g SD雄性大鼠25只(北京中医药大学实验动物中心提供)，DMEM-F12培养液(SIGMA公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青公司，中国)，碳花青荧光染料(CM-DiI)( MOLECULAR PROBES公司，美国)。

1.2 脂肪基质细胞的分离培养及形态观察

根据李东飞等[2]的方法，将1只SD大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，无菌条件下，超净台内取双侧腹股沟处皮下脂肪，并以PBS反复冲洗血迹，去除脂肪内的筋膜，将脂肪剪成糊状，加入2倍体积的1.5 g/L的Ⅰ型胶原酶，37 ℃ 恒温摇床振荡消化1 h。然后用等量的含10%胎牛血清的DMEM/F-12中和，以200目滤网过滤去除未消化组织，1000 r/min离心10 min(离心半径15 cm)，10%FBS的DMEM/F-12的培养瓶中，于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下进行细胞箱培养。3 d后除去非贴壁细胞，观察细胞形态及生长情况，待细胞生长铺满至瓶底约90%以上融合时，用0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA消化贴壁细胞，按同样的密度进行传代。取第3代以后的细胞，倒置相差显微镜下观察照相。

1.3 脂肪基质细胞的DiI荧光标记

将CM-DiI配制成2.5 μg/ml工作液，按2 ml/瓶加入铺满90%脂肪基质细胞的培养瓶内，37 ℃孵育5 min，4 ℃孵育15 min，PBS清洗2次。以0.25%胰酶消化，10%FBS的DMEM/F-12重悬，调节浓度为5×106/ml备用。

1.4 大鼠缺血皮瓣模型制备及分组

24只雄性SD大鼠，随机分为脂肪基质细胞组和生理盐水组，每组12只。每只SD大鼠以1%戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉，背部脱毛，在背部正中设计一宽3 cm、长8 cm矩形任意型皮瓣，沿设计线切开皮肤、皮下组织，达深筋膜浅层，保留真皮下毛细血管网，于深筋膜浅层表面分离皮下组织，皮瓣完全掀起后，彻底止血，间断原位缝合。模型建立后，脂肪基质细胞组用注射器吸取离心管中的细胞，注射于皮瓣的中点以及远端皮下，远端每1 cm为一段，每段注射含有脂肪基质细胞的数量约5×106/ml的细胞悬液各1 ml。对照组按照上法注射等容积的生理盐水，术后预防感染。为了减少操作带来的误差，所有手术均由同一实验者完成。

1.5 观察指标

1.5.1 大体观察 术后每天观察大鼠活动、饮食、精神状态、皮瓣颜色、肿胀、血运、伤口愈合、结痂等情况，10 d后测量皮瓣坏死区域的面积。皮瓣坏死面积=坏死的长度×坏死的宽度；皮瓣坏死率=皮瓣坏死面积/皮瓣总面积×100%。

1.5.2 组织学观察 术后第10天皮瓣中轴线上距蒂部4 cm处取皮肤全层，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，切片在20倍光镜下每张随机计算20个视野中血管断面数目，并计算血管断面密度。

1.5.3 脂肪基质细胞移植SD大鼠后的生物学观察 同样于皮瓣术后第10天切取冰冻切片，丙酮固定后在荧光镜下观察标记有CM-DiI红色荧光染料的脂肪基质细胞，以红色荧光的多少来反应脂肪基质细胞在SD大鼠皮瓣内的增殖及分布情况。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 脂肪基质细胞的分离培养及形态观察

在倒置显微镜下观察，接种到培养瓶内可见少量脂滴，24 h后待细胞贴壁后，更换培养液，去除油脂及未贴壁细胞；细胞开始大量生长，并呈现星形或多角形(图1)，成团成簇生长，并逐渐融合，呈铺路石样生长，待细胞生长铺满培养瓶或大部铺满后，经消化传代培养3～4 d，细胞增殖速度加快并开始互相融合；培养6～7 d，细胞可达90%以上融合，平行排列呈漩涡状或辐射状，细胞形态以长梭形为主，可传代(图2)。

2.2 脂肪基质细胞的DiI荧光标记

脂肪基质细胞染色后培养24 h，观察细胞均染色，显示红色荧光，再次传代后，细胞保持了正常的细胞形态，且胞浆染色均匀，细胞核未染色(图3)。

2.3 大体观察及组织病理观察指标

术后第2 天，两组皮瓣远端即出现不同程度皮肤缺血现象，皮肤变红或变黑，之后随时间坏死区域逐渐变大，术后第7 天变黑坏死区域趋于稳定。术后第10 天测量坏死面积，脂肪基质细胞组与生理盐水组相比，坏死面积较小(图4,5)。术后第10天脂肪基质细胞组皮瓣存活率为(67.4±5.1)%，生理盐水组皮瓣存活率为(52.5±6.5 )%，两组差异有统计学意义(P<0.05)。

脂肪基质细胞组肉芽组织较为丰富，细胞成分较多，有较多的新生血管(图6)；生理盐水组细胞成分少见，新生血管较少(图7)。脂肪基质细胞组和生理盐水组的皮瓣，平均毛细血管密度分别为(57.1±4.7)/mm2和(28.7±2.8)/mm2，差异具有统计学意义(P<0.05)。

荧光显微镜下，脂肪基质细胞呈红色，均匀分布在皮下筋膜层内，表明在细胞移植后第10天时，MSCs存活良好。脂肪基质细胞组的脂肪基质细胞参与到新生的血管中(图8)。

3 讨论

任意皮瓣由于具有使用方便、操作简单、不破坏主干血管、继发性损伤较小等优点而广泛运用于临床。任意皮瓣是临床上常用的一种皮瓣，由于其没有知名血管，毛细血管是这种皮瓣主要的血供，皮瓣内的血管数及循环是影响皮瓣成活的最主要因素，故超出一定的长宽比例往往会出现皮瓣远蒂端的缺血、缺氧或坏死。皮瓣坏死原因包括动脉供血不足、静脉回流不畅和缺血再灌注损伤、感染等。但是，由于任意皮瓣受到长宽比例限制，常难以修复较大范围的皮肤软组织缺损。因此，研究如何增加任意皮瓣长度和扩大皮瓣面积，以修复更大缺损，具有重要的临床意义[3]。

脂肪基质细胞内包含脂肪来源干细胞等细胞成分，脂肪来源干细胞具有良好的分化潜能，不仅能分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，还能分化为肌细胞和内皮细胞等[4]。脂肪来源干细胞作为一种多能干细胞，广泛存在于脂肪组织中，容易获得[5]且不需特殊培养，就可以获得大量干细胞，并且价格低廉，不存在排斥及伦理问题，被认为是最具有前景的多能干细胞，广泛应用于科学研究及再生医学领域[6]。脂肪来源干细胞的分离和培养已是一项比较成熟的技术，在基础研究中得到广泛应用，甚至已应用到临床工作中。

伤口愈合是一个复杂的过程，需要多种细胞及细胞因子的参与，而最近在创伤的研究中，脂肪来源干细胞已成为研究的热点。研究发现，在糖尿病小鼠模型中，局部应用自体的脂肪来源干细胞可以加速糖尿病溃疡的愈合[7]。临床研究发现，应用脂肪来源干细胞治疗放射性损伤可以减轻水肿，促进血管形成[8]。植入的脂肪来源干细胞可以增加循环血中内皮祖细胞的数量，这可能与其分泌的SDF-1有关。SDF-1是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族,循环血中的内皮祖细胞数量减少，脂肪来源干细胞对缺血肌肉的血管化效果则减弱。所以，脂肪来源干细胞的旁分泌功能在血管化过程中可能同样发挥着更重要的作用[9]。本实验中也观察到DiI标记后的脂肪基质细胞参与了血管的形成。脂肪基质细胞组皮瓣肉芽组织较为丰富，细胞成分较多，有较多的新生血管，通过组织学检查发现，血管密度的增加是皮瓣成活的主要原因。在显微镜下观察可见，脂肪基质细胞呈红色，均匀分布在皮下筋膜层内，表明在细胞移植后第10 天时脂肪基质细胞存活良好。脂肪基质细胞参与到新生的血管中，新分化的内皮细胞在形成细小血管的过程中发挥了作用，这是脂肪基质细胞组任意型皮瓣成活率提高的原因之一。脂肪来源干细胞与内皮细胞之间具有高度的协同作用，从而有效地促进了新血管生成，而这些新生的血管可以在几周内重建体内的血管网络，并保持其稳定性[10]。所以，脂肪来源干细胞在新血管生成方面具有更大的优势[11]，但本研究中的促进皮瓣存活的脂肪基质细胞中，是脂肪来源干细胞起到了一定的作用，还是其他细胞参与了血管的形成，有待进一步研究。

图1 脂肪基质细胞原代培养24 h (×100)图2 脂肪基质细胞原代培养6 d (×100)图3 DiI染色后培养24 h (×200)图4 脂肪基质细胞组术后10 d 大体观察图5 生理盐水组术后10 d大体观察图6 脂肪基质细胞组术后10 d组织学观察 (×100)图7 生理盐水组术后10 d组织学观察 (×100)图8 脂肪基质细胞组术后10 d DiI染色 (×200)

Fig1 Cells in primary culture of adipose-derived stromal cell for 24 hours (×100).Fig2 Cells in primary culture of adipose-derived stromal cell for 6 days (×100 ).Fig3 Cultured 24 hours after DiI staining (×200).Fig4 Observation of adipose-derived stromal cell group afer operation 10 days.Fig5 Observation of saline group afer operation 10 days.Fig6 Histologic observation of adipose -derived stromal cell group afer operation 10 days.Fig7 Histologic observation of saline group afer operation 10 days.Fig8 DiI staining of adipose -derived stromal cells group after operation 10 days (×200).

实验研究发现，通过酶联免疫吸附实验及相关技术检测脂肪来源干细胞，可以分泌一些可溶性的细胞因子，如肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子-α、白介素6、7、8、11等[12-14]。脂肪来源干细胞具有多能分化性，可分化成脂肪组织[15]、骨组织、软骨、肌肉及血管[16]等。本实验中并未涉及到这方面研究。

脂肪基质细胞如何参与皮瓣的存活过程，如何参与其中，起到了什么样的作用，作用机制如何，脂肪中的哪种细胞成分参与其中，是我们今后研究的方向。

[1] 田诗政, 杨志宏, 陆 华, 等. 大鼠骨髓间充质干细胞促进超比例任意皮瓣成活的初步实验研究[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2012,6(11):2941-2943.

[2] 李东飞, 杨 春, 李 桢, 等. 第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(23):4207-4210.

[3] 李光早, 孙庆章, 熊竹友, 等. 人脂肪干细胞对兔任意型皮瓣成活的影响[J]. 中华整形外科杂志, 2011,27(2):119-123.

[4] Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review[J]. J Nippon Med Sch, 2009,76(2):56-66.

[5] Sterodimas A, de Faria J, Nicaretta B, et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applicat-ions[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2010,63(1):1886-1892.

[6] Tobita M, Orbay H, Mizuno H. Adipose-derived stem cells: current findings and future perspectives[J]. Discov Med, 2011,11(57):160-170.

[7] Nambu M, Kishimoto S, Nakamura S, et al. Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice by autologous adipose tissuederived stromal cells combined with atelocollagen matrix[J]. Ann Plast Surg, 2009,62(3):317-321.

[8] Akita S, Akino K, Hirano A, et al. Mesenchymal stem cell therapy for cutaneous radiation syndrome[J]. Health Phys, 2010,98(6):858-862.

[9] 盛玲玲, 杨 湄, 李青峰. 细胞移植在皮瓣缺血治疗中的应用[J]. 中华整形外科杂志, 2010,26(3):234-237.

[10] Traktuev DO, Prater DN, Merfeld-Clauss S, et al. Robust functionalvascular network formation in vivo by cooperation of adipose progenitor and endothelial cells[J]. Circ Res, 2009,104(12):1410-1420.

[11] 鲍 菁, 刘 伟. 脂肪干细胞促新血管生成的研究进展[J]. 医学综述, 2010,16(18):2742-2745.

[12] Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J]. Circulation, 2004,109(10):1292-1298.

[13] Salgado AJ, Reis RL, Sousa NJ, et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2010,5(2):103-110.

[14] Kilroy GE, Foster SJ, Wu X, et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors[J]. J Cell Physiol, 2007,212(3):702-709.

[15] Brayfield CA, Marra KG, Rubin JP. Adipose tissue regeneration[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2010,5(2):116-121.

[16] Cherubino M, Rubin JP, Miljkovic N, et al. Adipose-derived stem cells for wound healing applications[J]. Ann Plast Surg, 2011,66(2):210-215.

Influenceofadipose-derivedstromalcellsonsurvivalrateofover-longflap

CHENXiao-fang,HUShou-duo,JIDong-shuo,etal.

(DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery，ThePekingHospitalofIntegratedChinesewithWesternMedicine,Beijing100039,China)

ObjectiveTo explore the influence of adipose-derived stromal cells on over-long flap survival.MethodsThe collagenase was used to digest fat from groin area of SD rat, the stromal cells obtained from separation culture and passages were stained by DiI. A over-proportionate random flap was formed at back of SD rat model, the stained adipose derived stromal cells were injected into the skin flap for treatment, physiological saline was also injected as control. General situation of the flap was observed, flap survival rate was calculated, the capillary density was observed by pathological section and the distribution of adipose-derived stromal cells within the skin flap and survival state were detected by fluorescence microscope.ResultsAt 10 days after operation, boundaries of the survival flap and the necrotic part was clear, The flap survival rate in the adipose-derived stromal cells group was obviously higher than that in the control group, they were (67.4±5.1) % and (52.5±6.5) % respectively (P<0.05). The blood capillary density in two groups were (57.1±4.7)/mm2and (28.7±2.8 )/mm2, respectively (P< 0.05). After injection of adipose stem cells into the SD rat skin flap, adipose-derived stromal cells survived and participated in the angiogenesis.ConclusionAdipose-derived stromal cells can significantly increase the survival area of the over-proportion random flap, it has potential worth of application and research in the clinical treatments.

Adipose-derived stromal cells； Overlength flaps; Rat

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.06.020

R318

A

1673-7040(2014)06-0374-04

2014-02-12)

陈晓芳(1978-)，女，河南人，主治医师，硕士.

胡守舵，100039，北京市中西医结合医院 整形美容科，电子信箱：hushouduo@126.com

100039 北京，北京市中西医结合医院 整形美容科