川贝母药材生物碱成分HPLC-ELSD特征图谱的研究

雷艳辉，李会军，李 萍

(中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏南京 210009)

川贝母基原复杂，《中国药典》2010年版规定了百合科贝母属6种基原植物，即川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母 F.przewalskii Maxim.、梭砂贝母F.delavayi Franch、太白贝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu，S.Wang et S.C.Chen［1］。由于这些基原植物分布区域重叠，种间变异复杂且外形相似，导致市场上川贝母药材往往基原混杂。因此，如何准确鉴别基原对于确保川贝母药材质量具有重要意义。

中药特征图谱是指某些药材、提取物或制剂经过适当处理后，采用一定的分析手段对其所含化学成分进行表征，得到的能够标示其化学特征的色谱或光谱图。由于色谱分析兼具分离、鉴别以及定量测定的能力，所得到的色谱图中各色谱峰蕴含有出峰顺序、保留时间、峰高、峰面积等信息，因此可以作为综合的量化色谱鉴别方法。中药特征图谱是中药整体性的化学表征，与采用单一化学对照品作对照的鉴别方法相比，具有更好的专属性［2］，已广泛应用于各种中药材和成方制剂的质量控制［3-10］。在《中国药典》2010年版中，有7种植物油脂和中药提取物的质量标准中应用了特征图谱鉴别方法。此外，《美国药典》、《欧洲药典》、《香港中药材标准》等均收载有植物药/中药特征图谱鉴别方法。

川贝母主含各类甾体生物碱［11］，本实验采用HPLC-ELSD方法，建立了针对川贝母所含甾体生物碱的特征图谱，以期对川贝母的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent1100 Series高效液相色谱仪 (美国Agilent公司);Alltech2000蒸发光散射检测器(ELSD);Milli-Q纯水仪 (美国 Millipore公司);KH-500DB型数控超声波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司);BT25S电子天平 (Sartorius);Heraeus PICO17离心机 (德国 Thermo公司);Oasis MCX 3 cc固相萃取小柱 (美国Waters公司)。

色谱纯乙腈 (德国Merck公司)，色谱纯甲醇(江苏汉邦科技有限公司)，其余试剂均为分析纯，超纯水 (18 MΩ·cm－1)由Milli-Q纯水仪制，西贝母碱、贝母辛、贝母素甲和贝母素乙对照品(实验室自制，HPLC测定纯度达98.5%以上)。

川贝母药材信息见表1，经中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室李萍教授鉴定，凭证标本存放于中国药科大学生药学教研室。

表1 川贝母药材来源Tab.1 Sources of Fritillariae cirrhosae Bulbus

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈 (A)-0.1%甲酸 (10 mmol/L甲酸铵，pH=4)(B)，梯度洗脱 (0～15 min，85% ～75%B;15～23 min，75%B;23～35 min，75% ～55%B;35～40 min，55%～0% B);柱温25℃;体积流量0.8 mL/min;进样体积20 μL;ELSD漂移管温度108℃;载气体积流量2.8 L/min。

2.2 混合对照品溶液的制备 取西贝母碱、贝母辛、贝母素甲和贝母素乙对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含西贝母碱0.3 mg、贝母辛0.2 mg、贝母素甲0.3 mg和贝母素乙0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末 (过60目筛)约3 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加5 mL浓氨水密闭浸润1 h，然后加入60 mL二氯甲烷-甲醇 (4∶1)混合溶剂超声处理1 h，滤过，滤渣用20 mL混合溶剂洗涤，合并滤液与洗液，蒸干，残渣用0.1 mol/L盐酸溶解，准备进行混合型阳离子交换 (MCX)固相萃取。先以3 mL甲醇活化，而后加3 mL水平衡MCX小柱;将0.1 mol/L HCl溶液溶解的样品转移至已活化的MCX小柱内;用3 mL 0.1 mol/L HCl及3 mL甲醇依次洗涤小柱除杂;用2 mL 10% 二乙胺甲醇溶液洗脱样品，洗脱液经氮气吹干后以1 mL甲醇涡旋复溶，离心取上清液即得。

2.4 方法学考察 以太白贝母 (TB-1)为实验材料进行方法学考察。

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下方法连续进样6次，记录色谱图，以贝母辛为参照峰，计算特征峰的相对保留时间。结果各特征峰相对保留时间的RSD值均小于0.4%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批样品 (TB-1)，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样，记录色谱图，以贝母辛为参照峰，计算特征峰的相对保留时间。结果各特征峰的相对保留时间的RSD值均小于0.3%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 耐用性考察

2.4.3.1 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进行测定，记录色谱图，以贝母辛为参照峰，计算特征峰的相对保留时间。结果各特征峰相对保留时间的RSD值均小于0.5%，说明样品溶液在24 h内稳定。

2.4.3.2 不同体积流量的考察 考察了不同体积流量 (0.8 mL/min、1 mL/min)对相对保留时间的影响。结果各特征峰分离程度无明显变化且相对保留时间的RSD值均小于1.9%，表明体积流量对相对保留时间的影响在可接受范围内。

2.4.3.3 不同柱温的考察 考察了不同柱温(25℃、30℃、35℃)对相对保留时间的影响。结果各特征峰分离程度无明显变化且相对保留时间的RSD值均小于1.0%，表明柱温对相对保留时间的影响在可接受范围内。

2.4.3.4 不同色谱柱的考察 考察了不同色谱柱Agilent Hypersil BDS-C18(4.0 mm ×250 mm，5 μm)、Kromasil 100-5C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)对相对保留时间的影响。结果各特征峰分离程度无明显变化且相对保留时间的RSD值均小于4.5%，表明色谱柱型号对相对保留时间的影响在可接受范围内。

2.4.3.5 不同仪器的考察 考察了不同仪器 (Agilent1100高效液相色谱仪、岛津LC-20AB高效液相色谱仪)对相对保留时间的影响。结果在这两种不同仪器上，各特征峰分离程度无明显变化且相对保留时间的RSD值均小于3.0%，表明不同仪器对相对保留时间的影响在可接受范围内。

2.5 川贝母特征图谱的建立 按“2.1”项下色谱条件对6批太白贝母样品进行检测，采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对所得HPLC色谱图进行匹配，时间窗0.50，采用中位数法生成太白贝母特征图谱匹配图，见图1，其中R为对照特征图谱。太白贝母特征图谱中标定了8个共有特征峰，其中4、5、6号峰分别是贝母辛、贝母素甲和贝母素乙。以贝母辛为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间 (表2)。

图1 太白贝母HPLC特征图谱匹配图Fig.1 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria taipaiensis

表2 太白贝母HPLC特征图谱共有峰的相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks of HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria taipaiensis

采用同样方法分别生成暗紫贝母、甘肃贝母、瓦布贝母的特征图谱匹配图 (图2～4)。暗紫贝母特征图谱中标定了4个共有特征峰，其中2号峰为贝母辛;甘肃贝母特征图谱中标定了7个共有特征峰，其中4号峰为贝母辛;瓦布贝母特征图谱中标定了8个共有特征峰，其中2、3、4、5号峰分别是西贝母碱、贝母辛、贝母素甲和贝母素乙。限于篇幅，暗紫贝母、甘肃贝母和瓦布贝母特征图谱共有峰的相对保留时间从略。

7批川贝母和7批梭砂贝母各批次间化学成分差异较大，无法建立特征图谱 (其HPLC重叠图分别见图5、图6)。

图2 暗紫贝母HPLC特征图谱匹配图Fig.2 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria unibracteata

3 讨论

3.1 色谱条件及样品溶液制备 生物碱类成分在色谱柱上易与反相填料的硅醇基发生反应而拖尾，为了改善样品的色谱分离行为，参照文献 ［12］的色谱条件，在0.1%甲酸溶液中加入10 mmol/L的甲酸铵，调pH为4后，发现生物碱类成分的色谱行为得到明显改善。

图3 甘肃贝母HPLC特征图谱匹配图Fig.3 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria przewalskii

图4 瓦布贝母HPLC特征图谱匹配图Fig.4 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria wabuensis

图5 川贝母HPLC重叠图Fig.5 Overlap of HPLC chromatograms for bulbs of Fritillaria cirrhosa

图6 梭砂贝母HPLC重叠图Fig.6 Overlap of HPLC chromatograms for bulbs of Friiillaria delavayi

未经前处理的药材样品色谱图较为复杂，经LC-MS鉴定后发现除了生物碱类成分外，还有一些非生物碱类成分，增加了谱图的复杂性。为了富集生物碱类成分，本实验使用混合型阳离子交换(Mixed-mode cationic-exchange，MCX)固相萃取小柱进行样品前处理。MCX固相萃取柱添加混合型阳离子交换反相吸附剂，具有离子交换色谱和反相色谱的双重保留模式，对碱性化合物具有高选择性和高灵敏度，适合用于贝母样品中生物碱的富集纯化。

3.2 特征图谱的比较 36批川贝母药材中，太白贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、瓦布贝母各批次药材化学组成相对稳定，可以建立基于共有峰模式的特征图谱;而川贝母和梭砂贝母各批次样品化学组成差异较大，无法建立特征图谱。由图1～4可知，虽然太白贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、瓦布贝母中均含有贝母辛，但整体化学成分表现出显著差异，可以通过特征图谱进行鉴别。

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