响应面分析法优化杜仲总木脂素提取工艺

潘亚磊，翟远坤，牛银波，李晨睿，武祥龙，梅其炳

(1.西北工业大学生命学院，陕西西安 710072;2.西北工业大学生命学院空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室，陕西西安 710072;3.第四军医大学药理教研室，陕西西安 710032)

杜仲Eucommia Ulmoides Oliv.，又名木棉(《木草图经》)，为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，我国特有药用植物，国家二级保护植物。 《神农本草经》将其列为上品，谓其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余沥。久服，轻身耐老”。近代药理学研究表明杜仲在抗肿瘤、防治骨质疏松、治疗心脑血管疾病、抗衰老、增强免疫力、安胎等方面有着良好的功效［1］。杜仲中的木脂素类化合物是杜仲的主要有效成分之一，是杜仲降压的主要组分［2-4］，具有防治绝经后骨质疏松［5］的作用。目前关于提取杜仲总木脂素的研究报道较少，邓翀等以正交试验优选出实验室提取杜仲木脂素的有效方法［6］。

松脂醇二葡萄糖苷是杜仲中含有量最丰富的木脂素类化合物之一，也是《中国药典》控制杜仲质量的所选参照化合物。本实验以松脂醇二葡萄糖苷为对照品，测定计算加热回流提取杜仲总木脂素得率。筛选出提取杜仲总木脂素的主要影响因素，再采用响应面法对主要影响因素进行优化，得到了提取杜仲木脂素的最佳工艺，为杜仲这一宝贵中药资源规模高效生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 杜仲购自陕西省石泉县，经陕西省药品检验所郭耀武主任药师鉴定为杜仲Eucommia Ulmoides Oliv.的皮;松脂醇二葡萄糖苷 (批号l11537-200501)由中国药品生物制品检定所提供，为含量测定所用。其余试剂均为分析纯。

U-3310分光光度计，日本日立公司;HC2168粉碎机，上海赛康电器有限公司;BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;N-1001旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;D-37520冷冻干燥机，德国Marin Christ公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总木脂素提取工艺流程 称量杜仲皮100 g→粉碎→过筛→加入溶剂→加热回流提取→趁热抽滤→滤液减压浓缩→转移至平皿－80℃预冻→低温冷冻干燥→得到粉末状固体。称量所得固体质量 (W，g)。

1.2.2 总木脂素得率测定方法

1.2.2.1 对照品溶液制备 精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品3.48 mg，甲醇溶解后定容于10 mL量瓶。

1.2.2.2 标准曲线制作 准确吸取“1.2.2.1项”中对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞试管中，挥干溶剂。每管依次加入10%变色酸溶液0.5 mL，浓硫酸3 mL，水1.5 mL摇匀，水浴加热30 min，冷却后摇匀［5-6］。紫外可见分光光度计560 nm处测定各管吸光度，每个样品平行测量3次。标准曲线为 y=0.1133 x－0.0071，r=0.998，松脂醇二葡萄糖苷在13.92～83.52 μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.2.3 加样回收率试验 精密称取“1.2.1”项中制备的总木脂素固体0.52 mg，甲醇溶解后定容于5 mL量瓶。准确吸取此溶液0.5 mL至5个具塞试管中，再分别加入“1.2.2.1”项中标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按照“1.2.2.2”项中方法测定吸光度，平均回收率为99.84%，RSD为2.78%。

1.2.2.4 精密度试验 精密吸取“1.2.2.1”项中对照品溶液0.5 mL于具塞试管中，按照“1.2.2.2”项中方法测定吸光度，重复测定5次，计算RSD为0.94%，表明精度较高。

1.2.2.5 稳定性试验 精密吸取“1.2.2.1”项中对照品溶液0.5 mL于具塞试管中，按照“1.2.2.2”项中方法测定吸光度，分别测定0、2、4、6、8、10 h的吸光度，计算RSD为1.57%，表明该方法稳定可靠。

1.2.2.6 总木脂素得率测定 适量精密称取“1.2.1”项制备的总木脂素 (M，g)，按照“1.2.2.2”项中方法测定吸光度，按照标准曲线计算得其中总木脂素的质量为 (N，g)，计算总木脂素得率Y=W×N/M%。

1.2.3 主要因素筛选 Plackett-Burman实验设计是一种二水平的实验设计方法，可用最少的实验次数达到使因素尽可能精确地估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究［7］。选用11因素(七个实际因素四个虚拟因素)、实验次数为12的Plackett-Burman实验设计方法筛选提取杜仲总木脂素的主要影响因素。因素及Plackett-Burman实验设计水平见表1。

表1 Plackett-Burman设计实验因素水平

1.2.4 工艺优化方法 根据Box-Bohnken中心组合试验设计原理，综合二水平结果，选取乙醇体积分数、提取时间和提取温度为考察对象，采用Design Expert 7.0统计分析软件的响应面分析法安排优化实验。响应面分析实验选取三因素三水平见表2。

2 结果与分析

2.1 主要因素筛选结果及分析 采用design expert 7.0软件，对Plackett-Burman实验结果进行分析，杜仲木脂素得率Y及各因素对得率的影响率见表3。

表2 响应面分析实验因素水平

表3的结果显示七个因素中，溶剂体积分数、提取时间和提取温度三个因素对木脂素提取影响较大，影响率都高于15%。溶剂种类对木脂素提取的影响率达到9.5%，但由于溶剂种类和溶剂体积分数这两个因素对结果的影响是共同作用的结果，从安全性考虑，故选择乙醇为提取溶剂。其余三个实际因素影响率都小于3%，说明粉碎程度、液料比和提取次数三个因素对结果影响较小，四个虚拟因素影响率也都小于3%，说明结果可信。因此选择乙醇体积分数、提取时间和提取温度三个因素对提取杜仲总木脂素的工艺进行优化。

2.2 提取工艺优化 采用响应面分析法优化主要影响因素。根据Box-Bohnken的中心组合设计原理，对Plackett-Burman实验设计筛选出的3个主要因素 (乙醇体积分数、提取时间和提取温度)，取三水平进行优化实验设计，其余因素从节约能源的角度考虑，选择二水平实验设计中的－1水平。实验结果见表4。

表4 Box-Behnken实验结果

2.2.1 回归模型的建立 利用Design Expert 7.0统计软件对表4数据进行二次多项回归拟合，以乙醇体积分数X1、提取时间X2、提取温度X3为自变量，总木脂素得率Y为因变量，获得杜仲中总木脂素提取的回归模型:

对回归方程进行方差分析，结果见表5。回归方程中各变量对响应值Y影响的显著性由F检验来判定。概率P(F＞Fa)值越小，则相应变量的显著程度越高，P(F＞Fa)＜0.01时影响为高度显著，P(F＞Fa) ＜0.05时影响为显著。各因素中X1、X3、和对响应值Y的影响极显著 (P＜0.01);X2对响应值 Y的影响显著 (P＜0.05);三个交互项X1X2、X1X3和X2X3对响应值Y的影响不显著 (P＞0.05)。模型的极显著，相关系数 R=0.9647，说明响应值的变化有96.47%来自于所选择的变量。回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用此模型对总木脂素提取效果进行描述。

2.2.2 杜仲总木脂素提取条件响应曲面分析与优化 应用响应曲面法对杜仲总木脂素提取的回归模型进行分析。通过固定一个因素在零水平，研究另外两因素对响应值Y的影响效果。经分析乙醇体积分数和提取温度两个因素在等高线下的曲率较大，而提取时间在等高线下的曲率较小，这和回归模型中X1和X3对响应值Y的影响显著性大于X2对响应值Y的影响显著性是一致的。响应面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值存在极高值，且最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。利用Design-Expert软件，对提取杜仲总木脂素的回归模型解逆矩阵得知，3个因素(乙醇体积分数、提取时间、提取温度)的最优实验点取值分别为 (62、113、72)，此时Y取最大值1.91。

表5 响应曲面的二次模型方差分析

2.3 验证试验 在乙醇体积分数、提取时间和提取温度取最佳条件，其他因素取Plackett-Burman实验设计中二水平的-1水平条件下，进行3次平行验证实验，验证实验结果。3次平行试验的Y均值为1.86，与预测值1.91的相对误差为0.26%，证明了回归模型较为准确可靠，达到了优化提取条件的预期目的。

3 讨论与结论

杜仲中木脂素类化合物有27种之多［8］，不易构建具有详细理论依据的提取模型，运用统计软件对Box-Bohnken中心组合实验设计所得的数据进行拟合，得到的模型属于经验模型。经验模型 (化学动力学模型)通过简单拟合方法得到参数值，虽缺乏理论推导验证，但所得模型简单且具有实用性［9］。

本实验先用Plackett-Burman二水平实验设计筛选出影响杜仲总木脂素提取的三个主要因素，即乙醇体积分数，提取时间和提取温度，再对这三个因素进行响应面实验设计及分析，得到了影响总木脂素提取的模型，对回归模型求解后，得到的最优提取条件参数为:乙醇体积分数62%，提取时间113 min，提取温度72℃，杜仲皮粉碎程度为40目，液料比为10∶1，提取次数为2次。此时，总木脂素得率为1.86%。邓翀等以甲醇为溶剂超声辅助提取杜仲总木脂素，虽然提取时间短，但超声提取方法受现代仪器设备的限制，主要用于实验室中药及其制剂分析方面［6］，本研究采用毒性小的乙醇为溶剂运用加热回流法提取杜仲总木脂素，经过优化提取条件后总木脂素得率更高，应用优化所得方法提取制备杜仲总木脂素，得率高，提取工艺简便，可广泛应用于大规模生产。

［1］李 竹，晏 媛，李 青.杜仲的药理活性研究进展［J］.中国药事，2004，18(2):67-68.

［2］宋 妍，许激扬.杜仲木脂素化合物降压药效学研究与机制初探［J］.中医药学刊，2006，24(10):1934-1936.

［3］吴卫华.杜仲抗高血压有效部位的制备及降压效应研究［D］.广州:中南大学，2007.

［4］Luo L F，Wu W H，Zhou Y J，et al.Antihypertensive effect of Eucommia ulmoides Oliv.extracts in spontaneously hypertensive rats［J］.J Ethnopharmacol，2010，129(2):238-243.

［5］张 蓉.杜仲防治绝经后骨质疏松及其机理研究［D］.西安:第四军医大学，2008.

［6］邓 翀，颜永刚，杨乖利，等.正交实验设计优化杜仲总木脂素提取工艺［J］.中国中医药信息杂志，2011，18(8):45-46.

［7］Ahuja S K，Ferreira G M，Moreira A R.Application of Plackett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium［J］.Biotechnol Bioengineer，2004，85(6):666-675.

［8］程光丽.杜仲有效成分分析及药理学研究进展［J］.中成药，2006，28(5):723-725.

［9］苏 辉，王伯初，刘玮琦，等.天然药物提取过程的动力学数学模型［J］.中草药，2011，42(2):384-391.