复方灵丹胶囊抗肝纤维化作用的实验研究

王化宇，牛俊奇，张炜煜*，金清龙*

(1.长春中医药大学，吉林长春 130117;2.吉林大学，吉林长春 130000)

肝纤维化 (Hepatic fibrosis)是由于肝炎病毒、酒精、药物、毒物、血吸虫等多种损伤因素长期刺激肝脏造成的一种常见慢性肝脏疾病，往往是导致肝硬化或肝癌发生的重要始动因素［1-2］。肝纤维化是一个可预防、可逆转的过程，一旦发展成为肝硬化，完全康复的可能性将会非常渺茫［3］。因此防治肝损伤和肝纤维化是临床肝病治疗的重要环节之一。

复方灵丹胶囊为吉林大学第一医院的院内制剂，由丹参、灵芝等药材组成，具有扶正补虚、活血化瘀、清利湿热之功效，主治正虚血瘀兼湿热证所致的病毒性肝炎、肝纤维化等症。本研究采用CCl4和高脂饲料复合诱导的大鼠肝纤维化模型，对复方灵丹胶囊抗肝纤维化作用进行研究，并初步探讨其抗肝纤维化的作用机制。

1 材料

1.1 药品和试剂 复方灵丹胶囊 (由吉林大学第一医院提供);透明质酸 (HA，20101005)，Ⅳ型胶原蛋白试剂盒(Ⅳ-C，20101005)，层粘连蛋白试剂盒 (LN，20111125)，超氧化物歧化酶试剂盒 (SOD，20110806)，丙二醛(MDA，20110806)，一氧化氮合酶 (NOS，20110806)，以上均购于北京鼎国生物技术有限责任公司;水合氯醛 (河北高碑店市春光试剂厂);肝素钠注射液 (徐州万邦生化制药有限公司)。

1.2 仪器 JA5103N电子分析天平 (上海民桥精密科学仪器有限公司)、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 (上海精宏试验设备有限公司);E53042432移液器 (日本NICHIRTYO);IKAT10匀浆机 (德国);BIO-RAD酶标仪 (美国);WFH-203J三用紫外可见分析仪 (上海精科实业有限公司)。

1.3 试验动物 Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量(200±20)g，清洁级，所有实验动物及饲料均购于吉林大学白求恩医学院实验动物中心，合格证号:2010-0005。

2 方法

2.1 复方灵丹胶囊的制备及用法 取处方量丹参和山豆根，加10倍量70%的乙醇浸泡30 min，加热回流提取三次，每次30 min，滤过，滤液合并，50℃下回收乙醇至无醇味;药渣与处方中其余药材混合，加10倍量水煎煮3次，每次30 min，滤过，滤液合并，浓缩，与醇提浓缩液混合，干燥至恒定质量，粉碎，加入处方量葫芦素混合均匀，加入3%滑石粉，用干法制粒，装胶囊，即得。

成人1日3次，一次3～5粒，按《药理实验方法学》［4］中方法换算成大鼠给药量，则高剂量组给药剂量为0.5 g(内容物)/kg(体质量)，低剂量给药组给药剂量为0.25 g/kg。

2.2 肝纤维化模型的建立［5-6］从Wistar大鼠中随机取出12只，雌雄各半，作为空白组，其余大鼠均以用84.5%玉米面加15%猪油和0.5%胆固醇制成的高脂饲料饲养，以30%白酒代替饮用水，同时皮下注射40%CCl4色拉油溶液，首次注射量为0.5 mL/100 g，之后每次注射量为0.3 mL/100 g，每隔3 d注射1次;空白组以正常饲料和自来水饲养，注射等量的色拉油，连续造模5周。

2.3 分组及给药 饲养五周后，将造模组存活下来的大鼠随机分成3组，分别为模型组、高剂量给药组和低剂量给药组，各组大鼠继续按上述方法饲养，同时高、低剂量给药组以复方灵丹胶囊混悬液灌胃，给药剂量分别为0.5g(内容物)/kg(体质量)和0.25 g/kg，空白对照组和模型组以等量生理盐水灌胃，每日给药，连续4周。

2.4 检测指标的测定

2.4.1 肝功能的检测［7-8］末次给药24 h后，腹腔注射10%水合三氯乙醛 (0.3 mL/kg)将大鼠麻醉，仰位固定，采用腹主动脉取血，血液放置30 min，以4000 r/min离心，取血清100 μL置于EP管中，对肝功能指标测定。

2.4.2 肝纤维化指标的检测［9-10］采用酶联免疫吸附法(ELASA)，按各试剂盒操作说明书中步骤进行试验，采用酶标仪测定血清中透明质酸 (HA)，Ⅳ型胶原蛋白 (Ⅳ-C)和层粘连蛋白 (LN)的水平。

2.4.3 抗氧化指标的检测 取大鼠部分肝部组织，精密称定，按质量体积比1∶3比例加入生理盐水，匀浆，以3600 r/min转速离心10 min，取上清液，采用ELASA法测定肝组织中丙二醛 (MDA)的水平及超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合酶 (NOS)的活性。

2.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析，实验数据以表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 肝脏表征观察 空白组大鼠肝脏为暗红色，表面光滑并有光泽，质软，边缘锐利;模型组大鼠肝脏为浅黄色，表面粗糙并失去正常光泽，质地变硬，边缘钝圆，部分大鼠肝脏明显肿大;低剂量给药组大鼠肝脏表面淡红色，与模型组相比表面光滑，色泽得到一定恢复，质地变软，边缘变薄，但没有恢复到空白组大鼠肝脏的状态;高剂量给药组大鼠肝脏与模型组相比表征得到明显恢复，部分大鼠肝脏基本恢复到正常状态。结果见图1。

图1 各组大鼠肝脏表征观察结果

3.2 肝功能检测结果 结果表明，与空白组相比，模型组大鼠的碱性磷酸酶 (ALP)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、谷氨酸转移酶 (GGT)、总胆红素 (TBIL)、直接胆红素 (DBIL)、间接胆红素(IBIL)的活性均极显著增高 (P＜0.001)，白蛋白 (ALB)的活性显著下降 (P＜0.01)，胆碱酯酶 (CHE)的活性极显著下降 (P＜0.01);与模型组相比，各给药组大鼠的ALP、ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL、IBIL的水平 (或活性)均极显著降低 (P＜0.001)，ALB的水平显著升高(P＜0.01)，CHE的活性极显著下降 (P＜0.001)，并且高剂量给药组各项指标与低剂量给药组相比也具有极显著性差异 (P＜0.001或P＜0.01)，部分指标基本恢复正常。结果见表1。

表1 血清肝功能指标检测结果 ()

表1 血清肝功能指标检测结果 ()

注:与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;与空白组比较，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01，ΔΔΔP ＜0.001;与低剂量给药组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001。下同

组 别 动物数/只 ALP/(U·L－1) ALT/(U·L－1) AST/(U·L－1) GGT/(U·L－1)空白组 12 148.4±34.7 63.9±12.5 131.1±19.7 0.22±0.44模型组 8 783.2±148ΔΔΔ 469.1±129.2ΔΔΔ 699.8±25.5ΔΔΔ 11.20 ±2.56ΔΔΔ低剂量组 10 287.3 ±51.5＊＊＊ 141.3 ±33.0＊＊＊ 345.5 ±33.0＊＊＊ 1.25 ±0.5＊＊＊高剂量组 10 149.7 ±40.1＊＊＊## 84.4 ±21.1＊＊＊## 143.0 ±16.7＊＊＊## 0.33 ± 0.5＊＊＊###组 别 CHE/(U·L－1) DBIL/(μmol·L－1) IBIL/(μmol·L－1) TBIL/(μmol·L－1) ALB/(g·L－1)533±127 0.58±0.2 1.6±0.2 1.4±0.2 31.4±2.98模型组 182±49ΔΔΔ 13.90 ±2.9ΔΔΔ 6.9±1.8ΔΔΔ 18.4±4.0ΔΔΔ 23.7 ±2.60ΔΔ低剂量组 367 ±71＊＊＊ 1.90 ±0.2＊＊＊ 3.5 ±0.3＊＊＊ 3.6 ±0.2＊＊＊ 31.1 ±1.01＊＊高剂量组 468 ±32＊＊＊## 0.70 ±0.1＊＊＊### 1.5 ±0.3＊＊＊### 1.4 ±0.3＊＊＊### 31.5 ±1.82空白组＊＊

3.3 肝纤维化指标的检测结果 结果表明，与空白组相比，模型组大鼠血清中层粘连蛋白 (LN)、Ⅳ型胶原蛋白(Ⅳ-C)和透明质酸 (HA)的水平极显著增高 (P＜0.001);与模型组大鼠相比，低剂量给药组大鼠血清中LN的水平显著降低 (P＜0.05)，HA和Ⅳ-C的水平极显著降低 (P＜0.01)，高剂量给药组大鼠血清中LN、HA和Ⅳ-C的水平均极显著降低 (P＜0.001)。结果见表2。

表2 肝纤维化指标检测结果 ()

表2 肝纤维化指标检测结果 ()

组 别 动物数/只 LN/(μg·L－1) HA/(ng·L－1) Ⅳ-C/(μg·L－1)12 131.68 ±33.21 122.21 ±28.16 89.28 ±18.24模型组 8 485.23±111.69ΔΔΔ 500.31±121.05ΔΔΔ 293.67±48.16ΔΔΔ低剂量组 10 327.99±102.41* 245.61±67.61＊＊ 199.5 ±58.49＊＊高剂量组 10 166.92 ±38.46＊＊＊## 133.89 ±34.61＊＊＊# 109.70 ±16.7＊＊＊#空白组

3.4 抗氧化指标的检测结果 结果表明，与空白组相比，模型组大鼠肝脏组织内丙二醛 (MDA)的水平和一氧化氮合酶 (NOS)的活性极显著增高，超氧化物歧化酶 (SOD)的活性极显著降低 (P＜0.001);与模型组相比，低剂量给药组大鼠肝脏组织中MDA的水平和NOS的活性显著下降(P＜0.05)，SOD的活性极显著提高 (P＜0.01)，高剂量给药组大鼠肝脏组织中MDA的水平和NOS的活性极显著下降，SOD的活性极显著提高 (P＜0.001)。结果见表3。

表3 抗氧化指标检测结果 ()

表3 抗氧化指标检测结果 ()

组 别 动物数/只 MDA/(nmol·mL－1) SOD/(U·mL－1) NOS/(U·mL－1)12 1.95±0.38 98.89±12.17 9.35±1.19模型组 8 5.01±1.48ΔΔΔ 25.34± 4.89ΔΔΔ 28.99±7.21ΔΔΔ低剂量组 10 4.13±0.98* 46.56±10.57＊＊ 20.97±4.81*高剂量组 10 2.23 ±40＊＊＊## 70.33 ±19.71＊＊＊# 13.37 ±3.29＊＊＊#空白组

4 讨论

根据文献资料及前期实验的经验，在造模过程中会有一部分大鼠死亡，所以本实验在操作过程中先造模再分组，以避免分组后造模的过程中某一组大鼠死亡过多，失去统计学意义。

ALP、AST、ALB等均为检测肝功能常用指标，其数值的大小可以直接反应出机体肝功能是否正常［11］，例如ALB是肝细胞特异分泌的功能性蛋白，当肝功能障碍时，肝脏合成总蛋白 (TP)减少，主要以白蛋白的下降最为明显;血清ALB能反映肝脏合成功能及其贮备能力［12］。试验结果表明，模型组大鼠ALP、AST、ALB等指标与空白组大鼠比较出现明显异常，证明此时大鼠的肝功能已经严重受损;给药后，大鼠各指标得到显著恢复，其中高剂量给药组大鼠部分指标已恢复到正常值，证明复方灵丹胶囊具有抗肝纤维化作用。

LN是细胞外间质中非胶糖蛋白的成分，当肝脏发生慢性炎症损伤时肝细胞、内皮细胞以及上皮细胞均参与合成LN，并在肝窦内大量累积［13］;HA是一种糖胺多糖，由间质细胞合成、分泌，肝脏受损时由于合成增多，肝脏代谢能力下降，血清HA水平增高。HA是反映肝纤维化最具价值的血清学标志物［14］;肝组织中Ⅳ-C的水平与肝纤维化程度成正比，观察Ⅳ-C的水平变化可以观察到肝纤维化病情的变化。试验结果表明，模型组大鼠血清中LN、HA、Ⅳ-C的水平均显著升高，表明其肝纤维化程度比较严重;给药后，各给药组大鼠血清中的LN、HA、Ⅳ-C的水平与模型组大鼠比较有显著下降，表明复方灵丹胶囊可以干预LN、HA、Ⅳ-C的合成，使其在血清中的水平降低以减少其在肝脏中的过度沉淀，达到抗纤维化的作用。

SOD为抗氧化酶，可以清除体内的氧化自由基;NOS为氧化酶，可以促进体内NO的合成;MDA为氧自由基和生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，可诱发细胞损伤［15-16］。以上三种物质均为公认的、常用的氧化指标。试验中模型组大鼠肝组织内NOS的活性显著升高，这与前期试验中模型组大鼠肝组织内NO的水平显著升高相对应;SOD的活性显著下降，同时MDA的水平显著升高，证明模型组大鼠肝脏氧化损伤严重。给药组大鼠与模型组大鼠比较，肝组织内MDA水平和NOS活性显著降低，SOD活性显著升高，表明复方灵丹胶囊可以提高体内抗氧化酶的活性，降低氧化酶的活性，清除体内过量的氧化基已达到抗氧化损伤的作用，保护肝脏。

综上所述，复方灵丹胶囊具有良好的抗肝纤维化作用，并具有一定量效关系，其作用机制可能与其具有抗氧化活性和减少LN、HA、Ⅳ-C在体内的合成有关。

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