刺五加多糖对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖和凋亡作用的实验研究

靳 祎，刘 超，范林林，胡亚楠，卢雪峥，王恩军

(1.河北大学基础医学院，河北保定 071000;2.保定市第一中心医院，河北保定 071000;3.保定市儿童医院，河北保定 071000)

中药刺五加Acanthopanax senticosus为五加科植物，其根、茎、叶均可入药，具有扶正固本、补肾安神的功效［1-2］。现代药理学研究证实刺五加具有提高免疫、延缓衰老、抑制血栓形成和抗肿瘤等作用［3］。刺五加中含有的主要活性成分是刺五加苷和多糖［4］，近年来，随着多糖分离技术的不断成熟，其多糖活性也得到了进一步验证。大量研究表明刺五加多糖具有很好的抗肿瘤作用［5］，具有巨大的开发潜能。本研究初步证实了刺五加多糖抗人宫颈癌Hela细胞增殖及促凋亡作用，并探讨其机制，为其应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

肿瘤细胞株HeLa 由河北农业大学生命科学学院提供。刺五加多糖原生药从河北安国县药材公司购买;采用热水浸提法［6］提取，通过苯酚-硫酸法检测含多糖量为75.12%，试验前用生理盐水配置成500 mg/mL的溶液。

1.2 试剂 胰蛋白酶和RPMI-1640培养液购自GIBCO公司，二甲基亚砜 (DMSO)、四甲基偶氮唑盐 (MTT)购自Sigma公司，顺铂为齐鲁制药有限公司产品，琼脂糖购自北京拜尔迪生物公司，溴化乙锭为研生生化试剂有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞抑制试验 (MTT法) 将密度为2×104个/mL的细胞接种于96孔培养板中，贴壁生长24 h后用于试验。分两组，对照组加入生理盐水，实验组加入不同质量浓度的刺五加多糖 (分别为1、2、4、8、16 mg/mL)，48 h后加入MTT液，DMSO溶解，震荡，酶标仪测定490 nm波长下各孔的吸光度值 (A490)，计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度 (IC50)。

1.3.2 细胞凋亡的检测

1.3.2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳 取2瓶对数生长期的细胞，密度为5×108个/mL，分两组，对照组加生理盐水，实验组加1.8 mg/mL的刺五加多糖，48 h后收集细胞，加细胞裂解液，蛋白酶K，然后经饱和酚、三氯甲烷/异戊醇多次抽提DNA，加醋酸钠、无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇漂洗。在2%琼脂糖凝胶上点样，1xTBE的电泳缓冲液电泳，紫外透射仪观察梯形条带并拍照。

1.3.2.2 促凋亡蛋白Bax的表达 采用免疫组化过氧化酶标记的链霉卵白素 (streptavidin peroxidase，SP)法，爬片经4%多聚赖氨酸预处理。细胞密度为2×105个/mL，培养24 h后，加入终质量浓度为1.8 mg/mL的刺五加多糖，培养48 h后，丙酮固定，血清封闭，滴加一抗、二抗工作液，辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察、摄片。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，所有数据用表示，组间比较使用方差分析。

2 结果

2.1 细胞增殖的抑制作用 HeLa细胞在不同质量浓度的刺五加多糖作用下，增殖明显受到抑制，A490值均下降，与对照组相比，差异有统计学意义 (P＜0.05，表1)，而且细胞抑制率随药物剂量增大而增强。通过MTT法作出的细胞生长曲线可以得出Hela细胞生长受抑制50%时的药物浓度即半数抑制浓度IC50为1.8 mg/mL(48 h)。

表1 不同质量浓度的刺五加多糖对HeLa细胞增殖的抑制率(n=4，)

表1 不同质量浓度的刺五加多糖对HeLa细胞增殖的抑制率(n=4，)

注:与对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组 别 质量浓度/(mg·mL－1)A490 HeLa细胞抑制率/%－ 0.847±0.002 －刺五加多糖组 1 0.533±0.005＊＊ 37.04±0.17刺五加多糖组 2 0.378±0.009＊＊ 55.36±0.14刺五加多糖组 4 0.255±0.010＊＊ 69.85±0.15刺五加多糖组 8 0.097±0.003＊＊ 88.56±0.21刺五加多糖组 16 0.048 ±0.011＊＊对照组94.36±0.20

2.2 凋亡细胞的凝胶电泳 对照组细胞DNA呈现一个高分子量条带，位于胶的顶部。刺五加多糖组细胞DNA呈现凋亡特异的降解片段，称为“DNA Ladder”(见图1)，表明刺五加多糖可诱导细胞凋亡。

图1 细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱

2.3 细胞中Bax蛋白的表达 Bax蛋白定位于胞浆，阳性产物染色呈棕黄色。在刺五加多糖的作用下，细胞中Bax表达明显升高 (图2)。由此说明，细胞的凋亡与Bax表达增强有关。

图2 细胞中Bax蛋白的表达 (SP，400×)

3 讨论

宫颈癌是女性第二大高发恶性肿瘤，临床治疗主要采用手术、放化疗等方法［7］。目前，随着研究的深入，抗宫颈癌的药物也由传统细胞毒性药物转向为多靶点、多机制的药物。天然中草药在宫颈癌的治疗方面有着很好的应用前景。近些年，有关中药及其有效成分的抗肿瘤作用研究也取得了重大成果，通过直接细胞毒作用、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性、抗肿瘤血管生成、增强机体免疫力、调节细胞信号转导、逆转多药耐药等多种机制起作用。研究表明，很多中药对宫颈癌有很好的抑制效果，而且一些单药提取物已应用于临床［8］。

刺五加属五加科，是草药刺五加的原植物。多年来，很多学者对刺五加的化学成分及药理作用进行了大量的研究，证实了刺五加的活性成分及其良好的药理作用。其中抗肿瘤作用作为刺五加研究中的一个热点备受关注［9-10］。研究表明:刺五加对多种肿瘤，如药物诱发性肿瘤、移植性肿瘤、肿瘤转移及小白鼠自发性白血病均有一定的抑制作用。且刺五加多糖对小鼠肉瘤 S180细胞、人白血病K562细胞体外增殖有较强的抑制作用，能抑制肿瘤生长，适于用作抗癌辅助药品［11］。本实验结果发现刺五加多糖对体外培养的Hela细胞增殖有很强的抑制作用，抑制率随其质量浓度增大而增强，显示较好的剂量依赖关系。刺五加多糖对Hela细胞的IC50为1.8 mg/mL。

肿瘤的发生不但涉及细胞的异常增殖和分化，并且与细胞凋亡受阻有关［12］。很多药物的抗癌机理都是诱导了肿瘤细胞的凋亡［13］。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，它参与肿瘤发生的起始，并对肿瘤的发生起负相调控作用，涉及到一系列基因的调控。Bax是目前研究最广泛且最深入的促凋亡基因之一［14］。很多报道显示Bax蛋白在宫颈癌的发展中表达逐渐缺失，促进了细胞癌变［15］。本实验中刺五加多糖作用 Hela细胞后，提取的DNA出现细胞凋亡的典型特征，有DNA Ladder凋亡条带出现，说明刺五加多糖可以诱导Hela细胞凋亡，并且Bax蛋白在多糖作用细胞后表达水平明显增加，证实Bax蛋白在Hela细胞凋亡过程中起到了促凋亡作用，增加了宫颈癌细胞凋亡的机会。以上结果表明，刺五加多糖是通过抑制细胞增殖和促进Bax蛋白表达增强、诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用的。

刺五加多糖的抗肿瘤作用机制复杂，是否还存在其他的作用机制有待于今后研究进一步阐明，相信随着对刺五加多糖研究的深入及其作用机制的揭示，必将对刺五加多糖应用于宫颈癌的临床治疗提供科学依据。

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