黄河口潮滩湿地土壤CH4氧化潜力及其对有机物输入的响应

孙万龙，孙志高，孙文广，翁虹，吕迎春，姜欢欢，王玲玲

(1.中国科学院海岸带环境过程重点实验室 山东省海岸带环境过程重点实验室 中国科学院烟台海岸带研究所，山东 烟台264003； 2.中国科学院大学，北京 100049；3.山东省农业可持续发展研究所，山东 济南 250100；4.山东省黄河三角洲生态环境重点实验室 滨州学院，山东 滨州 256603)

全球气候变化是当今人类面临的重大环境问题。CH4是引起全球变暖的重要温室效应气体之一，其对温室效应的贡献仅次于CO2和N2O，达25%[1]。尽管CH4在大气中的浓度低于CO2，但其热吸收效应却是CO2的15～30倍[2]。CH4还能与大气污染物(如氟利昂)发生反应，产生其他温室气体，如O3、CO和CO2等。全球大气CH4浓度已经由1750年的715×10-9增加到2005年的1774×10-9，并在2007和2008年分别增加了(8.3±0.6)×10-9和(4.4±0.6)×10-9[3-4]。据2011年世界气象组织发布的最新数据，2010年全球大气CH4浓度已高达1808×10-9，且正在以每年约1%的速度增加[5]。

湿地CH4排放是一个复杂的生物地球化学过程，它是湿地CH4产生、传输和氧化过程综合作用的结果。其中CH4氧化是控制CH4通量的重要因子，土壤中好氧微生物消耗大气中的CH4是湿地重要的CH4汇[6]。因此，探讨CH4氧化及其对不同因子的响应对于揭示湿地系统CH4排放的关键机制具有重要意义。目前，国外已在湿地土壤CH4氧化及其影响因子方面进行了较多研究，且这些研究主要涉及水稻田[7-9]、泥炭地[10-11]、淡水沼泽[12-13]和红树林[14]等湿地类型。与之相比，国内对湿地土壤CH4氧化的研究主要集中在人工湿地——水稻田的探讨上[15-18]，对天然湿地的研究主要集中于三江平原沼泽[19-22]、森林湿地[23-25]、长江口滨岸湿地[26-27]、闽江口湿地[28-29]以及若尔盖湿地[30-31]等。作为我国温暖带保存最完整、最广阔和最年轻的黄河三角洲滨海湿地生态系统，近年来已成为自然湿地研究的热点区域之一[32]，但关于温室气体排放特征的研究还很少[33-34]，而关于CH4氧化潜力的探讨还未见报道。黄河口潮滩湿地是黄河入海河段与渤海相互作用形成的重要生态类型，承接着来自黄河中上游带来的大量营养盐和有机物[35]。据统计，黄河2011年排放入海的营养盐和CODcr分别高达1.80万t和18.09万t[36]。大量营养盐和有机物的输入不仅对黄河入海口近岸水体的营养状况产生重要影响，而且其对于黄河口潮滩湿地营养水平的影响也非常深刻。可见，黄河口潮滩湿地充当着陆源碳氮的一个重要“汇”，但这一“汇”的形成究竟对CH4产生与氧化过程有何影响，目前尚不清楚。为此，本文以黄河口潮滩湿地土壤为研究对象，通过室内培养实验，初步探讨了CH4氧化潜力对有机物输入的响应。研究结果可为评价有机物输入对黄河口潮滩湿地CH4释放规律的影响提供重要科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

供试土壤采自山东省黄河三角洲国家级自然保护区今黄河入海口北部典型潮滩湿地。黄河三角洲国家级自然保护区(37°40′～38°10′ N, 118°41′～119°16′ E)位于东营市境内，总面积为15.3万hm2，是中国最大的河口三角洲保护区，主要保护新生湿地系统和珍稀濒危鸟类。保护区属暖温带季风气候区，具有明显的大陆性季风气候特点，雨热同期，四季分明，冷热干湿界限极为明显。该区年平均气温12.1℃，无霜期196 d，≥10℃的年积温约4300℃，年均蒸发量1962 mm，年均降水量为551.6 mm，70%的降水集中于7和8月。区域内的土壤类型主要为隐域性潮土和盐土，主要植被类型包括芦苇(Phragmitesaustralis)、柽柳(Tamarixchinensis)、碱蓬(Suaedasalsa)和獐茅(Aeluropuslittoralis)。作为潮滩湿地演替先锋阶段的碱蓬盐沼是黄河口丹顶鹤、白鹭以及鹆形目鸟类等的主要栖息地，同时还起着维持湿地系统正常演替，防风固堤，调节气候等重要功能[37]。

1.2 样地选择与样品采集

1.2.1样品采集 2010年11月初，在今黄河入海口北部滨岸高潮滩、中潮滩、低潮滩和光滩的典型试验区内进行0～10 cm深度土壤样品的采集，每个采样区设置3个重复。样品采集后立刻装入自封袋，封口后带回实验室风干备用。土壤基本理化性质测定方法分别为：电导率采用Field Scout土壤&溶液EC计测定；容重采用环刀法测定；总碳(TC)和总氮(TN)含量采用元素分析仪(Elementar Vario Macro)测定；NH4+-N 和NO3--N 含量在用2 mol/L的KCl溶液浸提后通过连续流动分析仪(Bran-Lubee AAA3)测定[33]。采样点表层土壤的基本理化性质见表1。

表1 采样点表层土壤基本理化性质

1.2.2CH4好氧培养试验 取风干后过60目筛(0.3 mm)的土样40 g放入到250 mL培养瓶中(设3个重复)，加入蒸馏水使培养瓶内土壤水分含量为田间持水量的70%(加水12.2 mL)，用玻璃棒搅拌使样品混合均匀成泥浆状。用硅橡胶塞塞住瓶口，瓶塞周围以704胶密封。在塞住瓶口的硅橡胶塞中间打2个孔，插入玻璃管，1根以适当长度插入泥浆中，作为CH4进口；另1根较短，稍稍插入培养瓶即可，作为CH4出口和气体取样口。通过取样口从培养瓶中抽取2.5 mL气体，然后再向培养瓶注入2.5 mL纯CH4，使瓶内CH4浓度为10000 μL/L左右(准确的初始浓度待确定)。将培养瓶放入 25℃培养箱振荡30 min(黑暗，120 r/min)，立即测定CH4浓度作为其初始浓度。然后继续放到此培养箱中恒温25℃培养，每隔12 h(或24 h)测定1次瓶中CH4浓度。每次测定CH4浓度时，先从培养瓶中抽取1 mL气样以N2稀释至10 mL，然后用Agilent 7890A气相色谱测定。实验连续培养6 d，共测定了9次CH4浓度。土壤CH4氧化潜力通过分析密闭培养一定时间后培养瓶内CH4浓度的变化来计算。为了比较不同有机物输入对CH4氧化潜力的影响，有机物输入实验组中分别加入提前配好的酵母膏溶液(2 mg)和甲醇溶液(2 mg)，对照组中则加入等质量的蒸馏水。

1.3 CH4氧化潜力计算

CH4浓度采用Agilent 7890A气相色谱仪进行测定。CH4检测器为FID(氢火焰离子化检测器)，载气为N2，流速为30 mL/min，燃气为H2，流速为45 mL/min，检测器温度为250℃，分离柱温度为55℃。CH4氧化潜力由下式进行计算：

式中，P为CH4氧化率(μg/g·d)；dc/dt为培养瓶内CH4浓度单位时间的变化(μL/L·d)；V为培养瓶内气体体积(L)；W为干土重(g)；MW为CH4的分子量(g)；MV为标准状态下1 mol气体的体积(L)；T为培养温度(K)。本研究采用25℃条件下CH4的氧化率来表征此状态下的CH4氧化潜力。

1.4 数据处理与分析

利用Origin 7.5软件进行计算和绘图，利用SPSS 20.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同潮滩湿地土壤的CH4氧化潜力

图1 不同潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力

由图1可知，尽管不同潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力存在一定差异(P>0.05)，但均具有相似的变化特征。12～60 h，CH4氧化潜力均呈先增加后降低变化，其中高潮滩、中潮滩和光滩土壤的CH4氧化潜力峰值均出现在第48 h(6.66，5.47和8.90 μg/g·d)，而低潮滩土壤则出现在第36 h(6.97 μg/g·d)。4种湿地土壤的CH4氧化潜力均在第60 h取得最小值(均为负值)，分别为-3.98，-2.72，-4.19和-4.62 μg/(g·d)，表明好氧培养期间仍可能有相当数量的CH4产生。60～132 h，4种湿地土壤的CH4氧化潜力均呈迅速增加趋势，其中中潮滩在第108 h出现CH4氧化潜力最大值(5.69 μg/g·d)，高潮滩、低潮滩和光滩则均在第132 h出现最大值(8.13，10.82和10.38 μg/g·d)。整体而言，4种湿地土壤的CH4平均氧化潜力表现为光滩(2.37 μg/g·d)>低潮滩(2.29 μg/g·d)>中潮滩(1.70 μg/g·d)>高潮滩(1.47 μg/g·d)，变异系数分别为145.80%，111.60%，166.23%和176.37%(表2)。

2.2 外源有机物输入对潮滩湿地土壤CH4氧化潜力的影响

由图2可知，无论有机质输入与否，不同潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力均随时间呈不规则波动变化。0～48 h，甲醇输入对4种湿地土壤CH4氧化潜力的影响均不明显。就高潮滩土壤而言，甲醇对其CH4氧化潜力的影响在第12 h表现为抑制作用，在第24 h表现为促进作用。36～48 h，甲醇对其CH4氧化潜力的影响又表现为抑制作用；与高潮滩不同，甲醇对中潮滩和低潮滩土壤CH4氧化潜力的影响在第12 h表现为促进作用，在第24 h表现为抑制作用，第36 h出现短暂促进作用，第48 h则又表现为较强抑制作用。对光滩而言，甲醇对其土壤CH4氧化潜力的影响在0～24 h内表现为抑制作用，在第36 h表现为促进作用，在第48 h再次表现为抑制趋势。4种湿地土壤CH4氧化潜力对甲醇输入的响应在60～132 h内较为一致。60～84 h，甲醇输入对CH4氧化潜力均产生弱抑制作用，在108～132 h则产生较强抑制作用。整体而言，甲醇输入抑制了4种湿地土壤的CH4氧化潜力，抑制程度表现为光滩>中潮滩>低潮滩>高潮滩(表2)。4种湿地土壤的CH4平均氧化潜力分别为1.27，0.49，0.67和0.38 μg/(g·d)，分别较对照组低13.56%，70.98%，70.65%和83.83%(表2)。

图2 不同潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力对有机物输入的响应

不同潮滩湿地表层土壤对酵母膏输入的响应在48 h培养期内亦无明显规律。酵母膏输入对高潮滩和低潮滩土壤CH4氧化潜力的影响在12～24 h内均表现为促进作用，在36～48 h内则表现为抑制作用。与之不同，酵母膏输入对中潮滩土壤CH4氧化潜力的影响在0～48 h内均表现为抑制作用，而对光滩土壤CH4氧化潜力的影响在0～12 h内表现为抑制作用，24～36 h内表现为促进作用，在第48 h又表现为抑制作用。4种湿地土壤CH4氧化潜力对酵母膏输入的响应在60～132 h内较为一致。60～84 h，酵母膏输入对CH4氧化潜力均表现为促进作用，在第108 h产生抑制作用后又表现为较强促进作用。整体而言，酵母膏输入促进了高潮滩、中潮滩和光滩土壤的CH4氧化潜力，促进程度表现为中潮滩>高潮滩>光滩。三者的CH4平均氧化潜力分别为2.41，2.89和2.96 μg/(g·d)，较对照增加64.01%，69.38%和24.76%(表2)。与之相比，酵母膏输入对低潮滩土壤的CH4氧化潜力产生弱抑制作用，其平均氧化潜力为2.14 μg/(g·d)，较对照降低6.67%(表2)。

表2 有机质输入对潮滩湿地土壤的CH4氧化潜力的影响

*，“-” 代表对CH4氧化潜力存在抑制作用；“+” 代表对CH4氧化潜力存在促进作用。*，“-” means decreasing CH4oxidation potential, while “+” means increasing CH4oxidation potential.

3 讨论

3.1 不同潮滩湿地土壤的CH4氧化潜力

本研究发现，4种潮滩湿地土壤在培养期内均表现出较强的CH4氧化潜力且变化规律较一致，其CH4平均氧化潜力表现为光滩>低潮滩>中潮滩>高潮滩，原因可能与4种湿地土壤的质地、有机质以及CH4氧化菌生物量等的差异有关。土壤质地是由不同大小土壤微粒的相对比例决定，主要影响土壤大孔隙和微孔隙的分布，从而决定了气体在土壤中的扩散速率。Drr等[38]和Kruse等[39]认为, 气体扩散率是影响CH4氧化最重要的因素之一。作为土壤中CH4氧化发生的底物和氧化性物质，CH4和O2的可获得性是土壤氧化CH4的重要限制因子。本研究中，4种潮滩湿地土壤的质地较为粘重(表1)且表层土壤粘粒和粉粒含量差异较大并表现出自高潮滩到光滩呈增加趋势[34]。这与前述4种潮滩湿地土壤CH4平均氧化潜力的大小顺序正好相反，说明土壤质地的差异可能使得CH4和O2在土壤中的扩散量存在差异，进而导致4种潮滩湿地土壤CH4氧化潜力的差异。相关研究也得到类似结果。王长科等[40]对不同土地利用方式下白浆土氧化CH4的研究发现，土地利用类型改变导致的土壤质地及理化性质的变化对CH4氧化具有显著影响，土壤结构改变，CH4和O2扩散发生困难从而降低了土壤的CH4氧化潜力。Boeckx等[41]对比利时10种不同土壤质地和土地利用类型土壤CH4氧化潜力的研究表明，不同质地土壤的CH4吸收率存在较大差异。Hütsch[42]曾发现免耕土壤氧化CH4速率是连续翻耕土壤的4.5～11倍(耕作可降低土壤容重)。土壤质地和理化性质的差异同样也会影响到土壤环境中的CH4氧化菌的生物量[43]。较高的土壤含盐量可降低土壤水势，导致CH4氧化菌出现生理性缺水，从而可降低土壤CH4氧化潜力[44]。这与研究区域土壤电导率越高CH4氧化潜力越低的研究结果一致。土壤有机质含量也是影响土壤CH4氧化潜力的重要因素之一[28]。Schnell和King[45]对林地土壤的研究发现，CH4氧化最强的为2～20 cm有机质层。王长科等[40]发现，在温度和水分一定的条件下，决定白浆土氧化大气CH4速率的最主要因素是土壤有机碳含量，土壤有机碳含量越大，土壤氧化大气CH4的潜力越大。王维奇等[28]的研究表明，土壤有机碳含量的差异是导致芦苇湿地土壤和光地土壤CH4氧化能力差异的重要控制因子。由于研究区域受外源有机质输入影响较大，所以土壤有机碳除来源于湿地植物外还在很大程度上取决于外源有机质的输入。由于潮间带高程自高潮滩到光滩呈降低趋势且光滩和低潮滩更易受到海水携带外源输入有机质的影响，所以在潮汐作用的影响下光滩和低潮滩易发生有机质的积累[46]，进而导致其土壤的CH4氧化潜力整体较高。

值得注意的是，培养期内某些时刻的CH4氧化潜力为负值，表明好氧培养期间仍可能有相当数量的CH4产生。由于CH4是在严格厌氧条件下由产CH4菌作用于产CH4底物的结果，所以理论上CH4应在极端还原条件下才能产生[47]。本研究中CH4氧化潜力负值的出现可能与主要土壤质地有关。尽管培养在好氧条件下进行，但由于供试土壤质地较为粘重，内部可能仍然存在厌氧微环境。有研究表明，颗粒很小的粘土能使得产CH4菌在有氧条件下存活[48]。在本研究温度、土壤含水量恒定且有机物质添加等量的情况下，土壤CH4产生主要应受供试土壤中产CH4菌数量和活性的影响，而产CH4菌的数量和活性则决定于是否存在适合的厌氧微环境。由于培养土壤内部可能仍然存在适合产CH4菌活动的厌氧微环境，所以当产CH4菌的数量和活性到达一定程度时，就会使得CH4的产生量超过氧化量，从而可能导致CH4氧化潜力负值的出现。好氧条件下CH4的产生或CH4氧化潜力为负值已为诸多研究所证实。徐华等[49]研究了好氧和厌氧状态下中国不同地区水稻土的CH4产生情况，发现水稻土在好氧条件下仍有相当数量的CH4产生。Boeckx等[41]对比利时10种不同土壤质地和土地利用类型土壤CH4氧化潜力的研究发现，草地重粘质土和粘质土出现CH4排放现象(即CH4氧化潜力为负值)。王长科等[40]研究表明，好氧培养条件下，旱田土壤底层土壤(23～37 cm)没有表现出吸收大气CH4的潜力，反而表现为排放CH4。另外，王长科等[21]在三江平原土壤氧化CH4的研究中亦发现，所选取的沼泽土和水稻土样品在培养期内均出现CH4氧化潜力为负值的现象。

3.2 土壤CH4氧化潜力对有机物输入的响应

本研究发现，甲醇输入对4种潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力整体均起一定抑制作用，且其对中潮滩、低潮滩和光滩土壤的抑制程度更强，原因可能与甲醇在CH4氧化细菌的代谢过程中抑制了其新陈代谢有关。甲醇是CH4氧化代谢途径的中间产物，对甲烷单加氧酶产生反馈抑制，从而抑制CH4的氧化。闵航等[44]对水稻土的CH4氧化潜力进行了研究，发现1 g供试土中甲醇浓度达到0.05 mg可抑制土壤氧化外源CH4活性50%左右。张光亚等[50]探讨了不同碳源物质对土壤CH4氧化活性的影响，结果发现甲醇输入后CH4氧化潜力与对照相差较大，9 d后CH4消耗量仅为对照的28%。姜欢欢[51]探讨了甲酸(同为CH4氧化代谢途径的中间产物)输入对黄河口潮滩湿地土壤(与本研究相同样点)CH4氧化潜力的影响，结果发现甲酸输入明显抑制了土壤CH4的氧化潜力，且其产生的抑制程度要大于本研究甲醇输入产生的抑制。原因可能在于，甲醇不但是CH4氧化代谢途径的中间产物，而且也是甲基营养型微生物的主要碳源物质，其影响强度较甲酸相对要弱[44]。本研究还发现，培养期间亦出现甲醇促进CH4氧化的情况，其原因可能是存在于土壤中少量的CH4氧化菌首先利用比较容易利用的碳源(甲醇)进行生长和繁殖，以达到较高的菌体数量；之后这些数量较多的CH4氧化菌就可以继续利用CH4为碳源继续生长和繁殖，从而表现出较强的CH4氧化潜力。这与Jensen和Priemé[52]发现在CH4浓度较低的条件下，甲醇的输入有利于土壤氧化CH4进行的研究结果相似。另外，由于甲醇是产CH4细菌所需的碳源物质且供试土壤中可能存在厌氧条件(可产生CH4)，所以培养过程中甲醇对CH4氧化的抑制作用往往受土壤产CH4的影响而表现稍弱[29]。

本研究发现，酵母膏输入对高潮滩、中潮滩和光滩表层土壤的CH4氧化潜力整体均起到促进作用，而对低潮滩土壤则起到弱抑制作用，原因可能与酵母膏对湿地土壤CH4氧化细菌繁殖影响的差异有关。酵母膏是促进产CH4菌产CH4活性的碳源物质，其在低浓度情况下就可促进土壤氧化外源CH4的活性。同时，酵母膏还可补充氮源和提供微生物生长的各种维生素、氨基酸及生长因子，可大大提高菌种的生存率和繁殖率。在土壤存在适合于CH4氧化微生物生长的微域环境时，酵母膏的输入保证了CH4氧化菌生长基质的充足，从而促进了CH4氧化菌的繁殖与生长[53]；当加入CH4后，这些甲烷氧化菌经过一段时间的适应后，可表现出较强的CH4氧化能力[54]。闵航等[44]对水稻土CH4氧化潜力的研究表明，1 g供试土中加入0.05 mg的酵母膏可提高25%左右的氧化外源CH4的活性。这与本研究中高潮滩、中潮滩和光滩土壤的研究结论相似。但姜欢欢[51]对黄河口潮滩湿地土壤(与本研究相同样点)CH4氧化潜力影响的研究发现，加入葡萄糖和乙酸钠(促进CH4菌产CH4活性的碳源物质，与酵母膏相似)在一定程度上抑制了土壤CH4氧化潜力，这与本研究中酵母膏输入对中潮滩土壤的CH4氧化潜力产生弱抑制的结论相近。原因可能在于，酵母膏作为产CH4底物，加入后在促进CH4氧化菌活性的同时也促进了产CH4细菌的繁殖[29]，从而导致可观的CH4在微厌氧环境下产生，但其具体机制仍需要进一步研究。

4 结论

1)潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力在培养期内变化规律相似，其值表现为光滩>低潮滩>中潮滩>高潮滩；不同潮滩湿地土壤CH4氧化潜力的差异可能主要与土壤质地的差异有关。

2)甲醇输入对潮滩湿地表层土壤的CH4氧化潜力整体表现为抑制作用，且抑制程度表现为光滩>中潮滩>低潮滩>高潮滩。

3)酵母膏输入对高潮滩、中潮滩和光滩表层土壤的CH4氧化潜力整体表现为促进作用，且促进程度表现为中潮滩>高潮滩>光滩；与之相比，酵母膏输入对低潮滩土壤的CH4氧化潜力表现为弱抑制作用。

4)在当前外源有机物为黄河入海主要污染物情况下，潮滩湿地的CH4源/汇功能将发生明显变化，这就使得在估算潮滩CH4排放清单时应特别关注不同有机物输入对CH4释放的影响。