行辅助生殖技术患者流产胎儿人白细胞抗原－G基因14bp插入／缺失多态性分析

李观贵，吴彤华，朱元昌，尹彪，宋成，陈晓燕，曾勇，林奇

（广东深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045）

约有10%～15%的人妊娠后流产，其中大部分的流产是由胎儿的遗传学异常，如染色体非整倍体、基因突变或多态性等引起。流产越早发生，胎儿的遗传学异常机率也越高［1］。研究表明，50%～80%的流产胎儿染色体为非整倍体，是引起流产的最主要原因［1］。然而，对于染色体数目正常的流产胎儿，其流产原因往往难以确定。

人类白细胞抗原G（HLA－G）属于I类非经典主要组织相容性复合物，限制性表达于母胎界面的外滋养层细胞。其可抵制自然杀伤细胞（NK细胞）、T淋巴细胞及树突状细胞等免疫细胞的功能，在胚胎种植及妊娠维持中发挥重要作用［2，3］。与其他HLA基因的高多态性不同，HLA－G的基因的多态性非常低，讫今仅发现23种等位基因。其中，HLA－G基因3’端非翻译区（3’－untranslated region，3’－UTR）的14bp插入／缺失多态性与 HLA－G的表达及功能密切相关［4，5］。

HLA－G基因14bp插入可导致其转录产生的mRNA在3’－UTR区缺失92bp长度的片段，影响mRNA的稳定性及翻译，从而使HLA－G的合成及浓度降低［5］。此外，行辅助生殖技术患者胚胎体外培养的培养液中可溶性HLA－G分子（由胚胎分泌）的浓度与胚胎着床成功与否呈正相关，表明胚胎分泌足够浓度的可溶性HLA－G分子对胚胎种植及妊娠维持至关重要［6，7］。因此，胚胎 HLA－G基因14bp多态性可能影响胚胎HLA－G的合成，进而导致胎儿流产。

有学者研究表明，母方的 HLA－G基因14bp插入／缺失多态性与复发性流产呈相关性，提示其在流产中发挥重要作用，然而这些研究未能排除胎儿的非整倍体情况［5，8］。胚胎滋养层细胞是表达HLA－G的主要来源，流产后的胎儿在排除染色体非整倍体后，其HLA－G基因14bp插入／缺失多态性情况与流产的相关性可能更为重要。

材料与方法

一、研究对象

2011年3月至2012年12月，于我院生殖中心行体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术治疗的患者，符合以下条件者入选：生殖系统无器质性病变；性激素正常；无已知的免疫性疾病；妊娠后12周内流产；流产物经多重连接依赖式探针扩增技术（MLPA，检测相关结果另文发表）检测23对染色体数目均正常［9］。共82例流产胎（IVF＋ICSI流产组）符合条件入选，其中通过IVF方式妊娠的流产胎47例（IVF流产组），通过ICSI方式妊娠的单胎胎儿35例（ICSI流产组）。同时，自然单胎妊娠且孕周≤12的患者于我院妇科行选择性人工流产，经MLPA技术检测23对染色体正常的胎儿共49例作为对照组。

二、样本收集

刮宫产物于生理盐水中清洗数遍，在体视镜下用剪刀分离绒毛或胎儿组织，并于生理盐水中冲洗3遍，以去除血块等母体成份的污染。胎儿组织用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取 DNA，按说明书操作。DNA保存于－80℃备用。

三、HLA－G基因14bp多态性分析

根据GenBank公布的人类HLA－G基因序列设计引物，正向引物序列：5’－GTG ATG GGC TGT TTA AAG TGT CAC C－3’（5’末端用荧光素标记），反向引物序列：5’－GGA AGG AAT GCA GTT CAG CAT GA－3’。应用上述引物使用 PCR 方法扩增 HLA－G基因3’－UTR区，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃再延伸5min。聚合酶链反应（PCR）产物用 Hidi－formamide（Applied Biosystems，美国）变性，以 LIZ－500（Applied Biosystems，美国）为标准品，于 AB 3500遗传分析仪（Applied Biosystems，美国）进行片段分析。PCR产物有224bp和210bp两种片段，其中224bp长度的序列代表14bp插入（＋14bp），而210bp长度片段代表14bp缺失（－14bp）。

四、统计学分析

用SPSS 16.0软件行t检验及卡方检验分析数据。如P＜0.05则认为有统计学差异。

结 果

一、PCR扩增与产物分析

通过PCR技术成功扩增到 HLA－G基因3’－UTR特异性片段，其中＋14bp片段长度位于224bp位置附近，－14bp片段长度位于210bp位置附近，与预期大小相符（图1）。两种片段产物经回收纯化后测序鉴定，确认与目标序列相符（图2）。

图1 HLA－G基因14bp多态性片段分析

图2 HLA－G基因14bp多态性测序结果

二、等位基因频率分析

IVF流产组HLA－G基因14bp插入的频率为35.11%，14bp缺失的频率为64.89%；ICSI流产组HLA－G基因14bp插入的频率为31.43%，14bp缺失的频率为68.57%；IVF＋ICSI流产组 HLA－G基因14bp插入的频率为33.54%，14bp缺失的频率为66.46%；对照组HLA－G基因14bp插入的频率为41.84%，14bp缺失的频率为58.16%。各组间等位基因多态性频率均无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

表1 流产组及对照组HLA－G基因14bp等位基因型频率分布比较

三、基因型频率分析

IVF流产组 HLA－G 基因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14的基因型频率分别为10.64%、48.94% 和 40.43%；ICSI 流 产 组 HLA－G 基 因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14的基因型频率分别为5.71%、51.43%和42.86%；IVF＋ICSI流产组 HLA－G基因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14 的 基 因 型 频 率 分 别 为 8.54%、50.00% 和41.46%；对照组 HLA－G 基因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14的基因型频率分别为18.37%、46.94%和34.69%。各组间基因型频率均无统计学差异（P＞0.05）（表2）。

表2 流产组及对照组HLA－G基因型频率分布比较

讨 论

辅助生殖技术已成为治疗不孕不育最有效的方法之一，然而治疗妊娠后的患者约有10%～15%会发生早期流产，是当前辅助生殖技术面临的主要问题之一。流产原因众多，其中染色体非常倍体最为常见，是引起流产的最主要原因［1］，但其他流产病因至今大部分仍不明确。HLA－G作为影响胚胎着床及妊娠维持的重要因子，其表达或功能异常可能是导致流产的原因之一。

在妊娠期间，胎儿能在母体宫腔内顺利发育而不被排斥，其主要原因是滋养细胞不表达经典的主要组织相容性复合体（MHC）I、II和III类分子，只表达非经典的MHC I类分子如HLA－G等。HLAG维持妊娠的机理包括：（1）直接或间接抑制NK细胞；（2）与蜕膜组织中的T细胞结合，抑制T细胞杀伤；（3）调节T辅助性细胞因子分泌，促使Th2偏移；（4）可溶性 HLA－G分子通过激活Fas／FasL旁路，引起活化母体CD8＋T细胞的凋亡［10］。1993年由Harrison等［11］首次报道了 HLA－G第8外显子（14－bp／14＋bp）多态性，在对灵长类动物的MHC－G进化过程研究中发现，这种14bp多态性属于缺失性多态，而非插入性多态。

早期研究主要关注母方或父母双方的HLA－G基因3’－UTR中14bp插入／缺失多态性与复发性流产的相关性，多数研究认为其与复发性流产的发生相关［5，8］，但也有文献报道两者无相关性［12］。 本文则对行辅助生殖技术后流产，经MLPA方法检测染色体数目正常的胎儿 HLA－G基因3’－UTR中14bp插入／缺失多态性进行分析，以期揭示其与流产发生的相关性。结果显示，HLA－G的等位基因频率及基因型频率在流产组及对照组中相当，无统计学差异，提示其可能不是导致流产发生的原因。Moreau等［13］研究发现，流产胎盘的 HLA－G基因14bp多态性与对照组相似，我们的研究结果与其一致。但是，本文仅对基因多态性进行检测，未对其表达产物进行定量分析。后期研究可进一步研究流产胎儿的不同14bp基因型的HLA－G的蛋白表达情况及其与流产的关系。

本研究观察到的一个现象：在对照组中HLAG基因＋14／＋14纯合基因型的频率较IVF组或ICSI组均高，这与我们的预期结果相反。Sipak－Szmigiel等［12］对波兰复发性流产患者进行研究时同样发现，对照组的＋14／＋14纯合基因型频率较复发性流产患者高，我们的结果与其类似。出现这种情况的原因目前仍不明确，可能与研究的样本数较少或人种有关。

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