退黄合剂对ANIT致胆汁淤积性肝损伤的保护作用及机制研究*

陈新瑜 李小清 况 舸 陈蓉春 胡文艳 龚 霞 万敬员△

（1.重庆市中医院，重庆 400021；2.重庆医科大学，重庆 400016）

胆汁淤积性肝炎是由于多种原因引起的胆汁分泌或排泄障碍，导致胆红素增高，最终出现肝细胞变性或坏死。其作为临床上最常见的肝炎之一，在中医学中属于“黄疸”范畴。目前，现代医学对其无特异性治疗手段，而中医在黄疸的治疗方面有其独特的疗效。中医学认为，湿邪是黄疸最主要的病因，无论阳黄，阴黄的发生均有湿邪内蕴，因此，清热利湿、疏利肝胆成为退黄的关键所在。退黄合剂是根据刘华宝教授经验方制成的合剂，该合剂由茵陈蒿、大黄、平地木、田基黄、苏木、瞿麦6味中药组方，具有清热利湿、化瘀退黄之功，使湿邪从二便而出，诸药合用，相须相使，相得益彰，共奏退黄之效而无损脾胃之弊［1］。本实验拟以ANIT诱导的胆汁淤积性肝损伤为模型，研究退黄合剂对其保护作用，并进一步探讨作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK（渝）20070001。

1.2 药物与试剂 退黄合剂（规格1 g/mL，产品批号13090902）由重庆市中医院制剂室提供，异硫氰酸-1-萘酯（ANIT）为上海阿拉丁公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、 天冬氨酸氨基转移酶 （AST）、 碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、髓过氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；ECL化学发光和BCA蛋白定量试剂盒（美国pierce公司），大鼠巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-2 ELISA检测试剂盒、细胞间黏附分子（ICAM）-1和β-ACTIN抗体（英国Abcam公司）。

1.3 仪器 BIORAD酶标仪（550），BIORAD电流和转膜仪，722分光光度计算，LEICA石蜡切片机，NIKON显微镜（TE-2000）。

1.4 分组与给药 将动物随机分成5组，即空白对照组，ANIT模型组，退黄合剂低、中、高剂量组，每组12只。空白对照组给等容积的生理盐水，ANIT模型组一次性灌胃 150 mg/kg ANIT［2］。退黄合剂低、中、高剂量组，分别给予退黄合剂每日 5、15、30 g/kg，灌胃 3 d，最后1次给药后30min一次性灌服150 mg/kg ANIT。

1.5 标本采集与检测 大鼠在ANIT灌胃48 h后处死，分别取血清和肝组织用于指标分析。取大鼠血液，离心（3000 r/min，10min）后取血清，按试剂盒说明书分别检测血清中 ALT、AST、ALP、DBIL 和 TBIL。取部分肝脏组织，4%多聚甲醛固定后梯度酒精脱水后石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜200倍下观察肝组织形态变化。取肝组织200 mg用加入蛋白酶抑制剂的组织裂解液提取总蛋白，并测定总蛋白浓度。随后按ELISA试剂盒说明书测定肝组织中MIP-2含量，以每毫克总蛋白标准化。用上述提取总蛋白按试剂盒说明书检测SOD活性。另取大鼠肝组织200 mg提取总蛋白，然后检测肝组织内MPO的活性，并计算每克肝组织中MPO的活性。免疫组织化学法检测ICAM-1表达，取100 mg肝组织研磨后裂解组织、提取蛋白，BCA法蛋白定量。取40 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，室温下封闭1 h；加入一抗4℃冰箱孵育过夜；脱洗3次，二抗孵育1 h，再脱洗5次后，ECL显色，X光片曝光，洗片。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较应用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血清转氨酶、ALP和胆红素水平比较 见表1。与空白对照组相比，ANIT模型组血清中ALT、AST和ALP酶的活性明显增高，同时血清中DBIL、TBIL也显著增加（P＜0.01）；而相对于ANIT模型组，退黄合剂低、中、高剂量组血清中ALT、AST和ALP活性尽管在低剂量组无显著差异（P＞0.05），但高、中剂量组显著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。而 ALP、DBIL、TBIL 退黄合剂各剂量组均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈剂量低赖性降低。

表1 各组大鼠血清中ALT、AST、ALP、DBIL和TBIL水平比较（）

表1 各组大鼠血清中ALT、AST、ALP、DBIL和TBIL水平比较（）

与空白对照组比较，*P＜0.01；与ANIT模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 各组肝脏组织形态学实验结果 见图1。空白对照组，肝小叶结构清晰，胆管区无明显异常，但在ANIT模型组的肝脏中，可见炎性细胞浸润，肝细胞变性、坏死，胆管上皮细胞结构破坏。退黄合剂可改善ANIT导致的这些病理改变，特别是在高剂量组，可见肝细胞坏死明显减少，胆管区结构清晰。

图1 各组肝脏组织形态学（200倍）

2.3 各组肝组织中MIP-2、MPO和SOD水平比较 见表2。与空白对照组比较，ANIT模型组肝内MIP-2生成和MPO活性显著增高（P＜0.01），但SOD的活性却明显降低（P＜0.01）；相对于ANIT模型组，退黄合剂呈剂量依赖地抑制MIP-2生成和MPO的活性，但却增高SOD的活性。

表2 各组大鼠肝组织中MPO、SOD活性及MIP-2水平比较（）

表2 各组大鼠肝组织中MPO、SOD活性及MIP-2水平比较（）

2.4 各组肝组织中ICAM-1表达的实验结果 见图2、表3。以内参蛋白β-actin的表达量标准化后，相对于空白对照组，ANIT模型组动物肝组织中ICAM-1的表达明显上调（P＜0.01），然而这种上调ICAM-1可被退黄合剂呈剂量依赖地下调。

图2 各组肝组织中ICAM-1表达水平

表3 各组大鼠肝组织中ICAM-1表达量（）

表3 各组大鼠肝组织中ICAM-1表达量（）

与 ANIT模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，△P＜0.01。

3 讨 论

ANIT是一种肝毒性物质，主要影响胆管上皮细胞和肝细胞，导致肝内胆汁淤积性肝损伤，表现为血液中胆红素和转氨酶的显著增高［2］。本研究发现，退黄合剂可呈剂量依赖性地改善ANIT诱导的这种肝损伤，包括减少转氨酶和ALP的活性，降低血清中DBIL和TBIL的含量，减轻肝脏的病理性改变。因此，退黄合剂对ANIT致胆汁淤积性肝炎有保护作用。

先前的研究表明，中性粒细胞介导的炎症反应在ANIT致胆汁淤积性肝炎发病中扮演着重要的作用［3］。ANIT损伤胆管细胞和肝细胞，释放一系列介质，通过募集大量的中性粒细胞，产生活性氧，引起肝脏的炎症反应，加重胆汁淤积和肝脏的坏死。在本研究中，笔者发现ANIT处理的大鼠肝脏中MPO活性显著增高，而退黄合剂剂量依赖地抑制MPO的活性。由于MPO是中性粒细胞特异性标志分子，因此，这一结果提示，退黄合剂能有效地减轻肝脏中性粒细胞的浸润。另外，浸润的中性粒细胞通过NADPH氧化酶生成大量活性氧，氧化肝脏中的还原酶如SOD等，阻断这些还原酶的活性。基于此，笔者也分析肝脏中SOD活性，其结果也显示，退黄合剂明显改善ANIT抑制的SOD活性。MIP-2被认为是促进中性粒细胞浸润的最主要趋化因子，可通过和中性粒细胞上的CXCR2受体结合，吸引中性粒细胞的募集。Xu等［4］在研究中发现，ANIT致肝内中性粒细胞浸润，是通过诱导肝细胞释放MIP-2实现的，CXCR2敲除的肝脏内中性粒细胞明显减少，且ANIT诱导的肝损伤也显著减轻。通过酶联免疫法进一步检测肝组织内MIP-2的含量，笔者发现：相似于MPO的结果，退黄合剂也呈剂量依赖性地抑制ANIT诱导的肝内MIP-2的生成。事实上，在炎症细胞浸润过程中，除了趋化因子，也涉及到一些黏附分子。ICAM-1是一个重要的黏附分子，能介导重要的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞等的浸润，ICAM-1和Mac-1参与肝脏内中性粒细胞的募集和活化［5］。通过免疫印迹法笔者也发现退黄合剂能抑制ANIT上调的ICAM-1的表达。

总之，通过本研究可以发现，退黄合剂是一种有效的肝脏保护和降低黄疸的中药方剂，其作用机制可能涉及到通过降低MIP-2的生成和ICAM-1的表达，从而减轻肝脏中性粒细胞引起的炎症反应。

［1］魏日胞，霍海如，周爱香.退黄合剂主要药效学研究［J］.中药药理与临床，2001，17（2）：33-34.

［2］Kobayashi M，Higuchi S，Mizuno K， et al.Interleukin-17 is involved in alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury in mice［J］.Toxicology，2010，275（1-3）：50-57.

［3］Hill DA，Jean PA，Roth RA.Bile duct epithelial cells exposed to alpha-naphthylisothiocyanate produce a factorthat causes neutrophil-dependenthepatocellularinjuryinvitro ［J］.Toxicol Sci，1999，47（1）：118-125.

［4］Xu J，Lee G，Wang H，et al.Limited role for CXC chemokines in the pathogenesis of alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，287（3）：G734-741.

［5］Luyendyk JP，Flanagan KC，Williams CD，et al.Tissue factor contributes to neutrophil CD11b expression in alphanaphthylisothiocyanate-treated mice［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，250（3）：256-262.