大黄上清液联合母乳对Caco-2炎症细胞Toll样受体表达的影响*

冯伟伟 阮为勇 步伟全

（江苏省中西医结合医院，江苏 南京 210028）

新生儿学在近年取得了很大进步，但仍有许多相关疾病的发病机制尚未完全清楚。新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）就是其中之一。大量的临床及实验研究证实应用大黄及母乳喂养防治NEC有良好的前景。Lucas A等［1］通过临床研究证实，单纯母乳喂养新生儿的NEC的发病率较人工喂养新生儿明显偏低。相关中医的临床及实验也证实，生大黄在防治NEC方面显示了较好的临床效果，且应用前景广泛［2-3］。近年来的研究认为：NEC的发病机制可能与Toll样受体（TLR）、脂多糖 （LPS）及NF-κB信号传导的异常激活有密切关联。TLR4是目前研究较多的Toll样受体之一，TLR4的相关作用机制为：识别脂多糖（LPS）并介导其跨膜信号转导，进而激活炎症因子，受LPS活化后的TLR4进一步启动相关肠道黏膜细胞的炎症反应，该机制已被证实与包括NEC在内的许多感染性疾病密切相关［4-8］。母乳防治NEC有显著的疗效，母乳中含有免疫球蛋白、乳铁蛋白、淋巴细胞、巨噬细胞、溶菌酶等多种免疫调节因子，以及表皮生长因子、双歧因子、核酸等多种生物活性物质，上述因子能够显著改善胃肠道的免疫防御功能，使其免受致病菌侵犯并减轻炎症损伤；大黄可“荡涤胃肠、推陈致新、调中化食，安和五脏”［9］，其主要作用部位在肠道，能够促进胃肠道蠕动、保护黏膜屏障，同时有清除肠道内细菌和内毒素、预防肠道细菌易位、改善微循环、促进胃肠道新陈代谢、调节免疫等功效。目前尚未见有关大黄及母乳对NEC肠道炎症细胞Toll样受体表达影响的报道。本课题拟探讨在大黄上清液及母乳的干预下Caco-2炎症细胞Toll样受体表达的变化，进一步揭示防治NEC的具体作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 母乳及大黄有效成分的提取 （1）母乳上清液的提取：母乳来自于江苏省中西医结合医院妇产科产妇6例，每位产妇均产出1名足月儿且无妊娠期并发症。生后2～4 d的母乳存于4℃冰箱，在24 h内处理，12000 r/min离心10min去除脂肪成分和细胞碎片，保留乳清用于实验，然后存于-20℃冰箱备用。（2）大黄上清液的提取：江苏省中西医结合医院中药房提供生大黄粉1 g加入磷酸盐缓冲液 （PBS）5 mL搅拌混匀，静置10min后取其上清液为淡黄色母液，分别配制为0.1%、1%、2.5%3个不同的大黄浓度。

1.2 细胞与试剂 Caco-2细胞株（购自中科院上海细胞 库 ）；Dual-luciferase reporter assay system （promega usa）；人外周血红细胞裂解液（中国深圳晶美生物工程有限公司）；无水丙酮（中国长沙丽欣生物工程有限公司）；多聚赖氨酸（中国长沙丽欣生物工程有限公司）；逆转录试剂盒 （美国MBI Fermentas公司）；PCR试剂盒（美国MBI Fermentas公司）；Tr1201试剂（美国Ivitrogen公司）；DNA Marker DL 2000（中国大连宝生物技术有限公司）；琼脂糖（BBI公司，由中国上海生物工程技术服务有限公司分装）；Tris碱、0.5×TBE电极缓冲液、硼酸等试剂为国家分析纯产品（中国上海生物工程技术服务有限公司）；PCR引物（中国上海生物工程技术服务有限公司）：GAPDH 引物 F：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH 引物 R：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3 主要仪器 5415R高速台式离心机（Germany，Eppendorf）；7500 荧光定量 PCR 仪（USA，ABI）；CentroX3超灵敏微孔板发光检测仪（Germany，BERTHOLD）；Mini Trans-Blot转移电泳槽、Mini ProteanⅢ蛋白垂直电泳槽、PowerPac 200/HC/3000电泳仪、Mini-Sub Cell GT 水平电泳槽 （USA，BIO-RAD）；EDC-810 PCR仪（中国，东胜）；311/3141细胞培养箱（USA，ThermoFisher），d-63450 生物安全柜（Germany，Heal Force）；凝胶成像仪（England，Syngene）；ND-1000核酸蛋白测定仪 （USA，Nano Drop）；ELx 808酶标仪（USA，BIO-TEK）。

1.4 Caco-2细胞培养 Caco-2细胞适宜在37℃、5%CO2和90%相对湿度的环境中培养，采用DMEM培养基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-链霉素双抗液。细胞培养在75 cm2培养瓶中，每5日按1∶3的比例传代，传代后6～7 d细胞生长达到融合。

1.5 炎症细胞模型分组 （1）对照组：检测正常Caco-2细胞中Toll样受体mRNA表达。（2）TNF-α诱导组：向TNF-α诱导的Caco-2炎症细胞中同时加入常规培养液，继续培养24 h，检测Caco-2细胞中Toll样受体mRNA 表达量。（3）TNF-α+1%大黄组：向 TNF-α 诱导的Caco-2细胞中加入1%大黄上清液，继续培养24 h，检测Caco-2细胞中Toll样受体mRNA表达量。（4）TNF-α+1%母乳组：向TNF-α诱导的Caco-2细胞中加入1%母乳上清液，继续培养24 h，检测Caco-2细胞中Toll样受体mRNA表达量。（5）TNF-α+1%大黄+1%母乳组：向TNF-α诱导的Caco-2细胞中同时加入1%大黄上清液和1%母乳上清液，继续培养24 h，检测Caco-2细胞中Toll样受体mRNA表达量。

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件处理。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为有统计学意义，以P＜0.01为有显著意义。

2 结 果

各组实验细胞中Toll样受体mRNA的相对表达量见表1。由实验结果表明，1%的大黄上清液、1%母乳及两者联合联合均可降低Caco-2炎症细胞TLR4 mRNA的表达，与TNF-α诱导组比较均有显著差异（P＜0.01）；1%大黄联合1%母乳干预较1%大黄干预作用明显，有显著统计学差异（P＜0.01）；1%大黄联合1%母乳干预较单用1%母乳干预作用明显（P＜0.05）；1%母乳干预较1%大黄干预作用明显，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组TLR4 mRNA的表达（）

表1 各组TLR4 mRNA的表达（）

与TNF-α诱导组比较，*P＜0.01；与TNF-α+1%大黄+1%母乳组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3 讨 论

NEC是新生儿尤其是早产儿常见的消化道危急重症，新生儿重症监护病房中NEC的发生率为1%～5%，而在极低出生体重儿中发生率高达5%～10%。NEC的死亡率可高达32%，近年来随着小儿外科和重症医学的进步，NEC病死率已下降到20%左右，NEC在NICU中的高发生率和死亡率对早产儿预后产生重要的影响［10］。治疗方面，近年来，有报道应用大黄及母乳防止NEC取得了良好的临床疗效。关于两者防治NEC的具体作用机制罕见报道，本实验体外培养了与人肠上皮细胞生物学功能相似的人结肠腺癌细胞系，并用TNF-α刺激该细胞，以模拟肠道的炎症反应，探讨炎症状态时肠上皮细胞的生物学功能。对于本病的发病机制，研究表明可能与TLR、NF-κB信号传导的异常激活及LPS相关。

本课题主要研究指标之一TLR4，主要识别LPS等炎症介质并介导其跨膜信号转导激活炎症因子，TLR4在受LPS活化后，将启动一系列肠道黏膜细胞的炎症反应，这已被证实与包括NEC在内的多种感染性疾病密切相关［4］。Toll样受体是一种免疫受体，具有跨膜信号转导功能，能够识别存在于病原体细胞表面的分子标志，并与其结合产生信号转导，最终触发炎症反应［5-6］。TLR4是Toll样受体中研究较为深入的，其能识别相关细胞因子并结合成复合物，进一步将此信号转入细胞内，最终激活核转录因子NF-κB，NF-κB作为促炎症基因表达的枢纽之一［4］，在静息状态下κB抑制蛋白（IkB）和NF-κB结合在一起存在于胞质中，当细胞受到缺氧、感染及炎性细胞因子等刺激后，IκB激酶发生降解，继而NF-κB进入细胞核内发挥其基因调控作用，NF-κB 活化后可增强 TNF-κB、IL-6 等炎症因子基因的信号表达，上调炎症反应使TNF-α、IL-6等炎症因子产生释放增多；然而TNF-α、IL-6等炎症因子又可以进一步激活NF-κB，导致最初的炎症信号进一步放大，造成过度的炎症反应。

本研究结果显示，1%大黄上清液、1%母乳上清液、1%大黄上清液联合1%母乳上清液对Caco-2炎症细胞Toll样受体mRNA的相对表达量均有明显抑制作用，相对于加入常规培养液的TNF-α诱导组（均P＜0.01），差异有显著统计学意义。1%大黄上清液联合1%母乳上清液组较1%大黄上清液组效果更明显（P＜0.01），两组差异有显著统计学意义；1%大黄上清液联合1%母乳上清组较1%母乳上清液组作用强，差异有统计学意义（P＜0.05）；1%母乳上清液组较1%大黄上清液组作用强，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

本试验结果可以证明，经TNF-α刺激后，Caco-2细胞中高表达TLR4。分别予以大黄上清液、母乳及两者联合干预炎症细胞模型后，Toll样受体mRNA的表达量有不同程度下降，说明Toll样受体参与了NEC的发病过程，且说明1%大黄上清液、1%母乳上清液、1%大黄上清液联合1%母乳上清液可降低Caco-2炎症细胞Toll样受体mRNA的过度表达，从而起到延缓NEC进展的作用。

［1］Lucas A，Cole TJ.Breast milk and neonatal necrotising enterocolitis［J］.Lancet，1990，336：1519-1523.

［2］周于新，沈迎春，张双船，等.生大黄防治新生鼠缺氧肠黏膜损伤作用的机制［J］.实用儿科临床杂志，2007，22（2）：142.

［3］陈德昌，杨兴易，景炳文，等.大黄对危重症患者应激性胃肠粘膜病变的治疗作用及其机制的研究［J］.中国危重病急救医学，1996，8（7）：395.

［4］Cynthia L，Leaphart，Jaime Cavallo，et al.Acritical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair ［J］.J Immunol，2007，179（7）：4808.

［5］张金萍，陈超，杨毅，等.Toll样受体2和4在新生儿感染时的变化及其临床意义［J］.中华儿科杂志， 2007， 45（2）：130-133.

［6］Medzhitov R，Janeway C.The Toll receptor family and microbial recognition［J］.Trends Microbio，2000，8（10）：452-456.

［7］Beutler B.Inferences，questions and possibilities in Toll-like receptor signaling［J］.Nature，2004，430（6996）：257-263.

［8］Medzhitov R，Preston-Hurlburt P，Janeway CA.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388（6640）：394-397.

［9］牟宜坤，李玛琳，杨为民，等.大黄对胃肠道作用及其机制探讨［J］.医学综述，2003，9（2）：125-126.

［10］陈超.新生儿坏死性小肠结肠炎的热点问题［J］.中国循证儿科杂志，2011，6（5）：321.