半夏提取物对小鼠肺水通道蛋白5表达的影响

周建龙，邓青南，梁 静（广州军区广州总医院，广州510010）

半夏提取物对小鼠肺水通道蛋白5表达的影响

周建龙，邓青南，梁 静
（广州军区广州总医院，广州510010）

目的 了解急性肺损伤（ALI）小鼠肺组织中水通道蛋白5（AQP5）的表达变化，探讨半夏提取物（EP）治疗ALI的药理机制，为半夏的临床应用提供理论基础。方法 36只昆明种小鼠随机分成3组，即空白对照组（NS组）、肺损伤造模组（ALI组）和半夏提取物治疗组（EP组），6 h后观察测定肺组织湿干重比值（W/D），HE染色光镜下观察肺炎症变化，ELISA法检测小鼠血清TNF-α浓度，RT-PCR检测肺组织匀浆AQP5 mRNA表达情况。结果 ALI组小鼠肺部炎症反应显著，中性粒细胞浸润为主，同时肺泡明显充血水肿。EP组肺组织炎症减轻、充血消退。与NS组和EP组比较，ALI组的W/D值差异有统计学意义（P＜0.05）；ALI组肺组织AQP5 mRNA的表达，较NS组显著降低，较EP组的表达显著升高（P＜0.05）。ALI组血清TNF-α的表达，较NS组显著升高，较EP组的表达显著降低（P＜0.05）。结论 半夏提取物可通过上调肺AQP5的表达减轻肺水肿，作用机制可能是通过抑制炎症因子TNF-α的表达实现的。

肺损伤；半夏提取物；水通道蛋白5；小鼠

急性肺损伤是呼吸系统常见重症，致残率和病死率高，目前研究［1］发现水通道蛋白（AQP），尤其是AQP5在维持肺泡内外稳态平衡起到关键作用。中医中药对急性肺损伤有明显的治疗效果［2-3］，半夏提取物或复方半夏汤剂均发现可调节AQP在肺组织内的表达［4］，但半夏能否通过调节AQP来减轻或治疗急性肺损伤目前尚无研究。本实验通过观察半夏提取物对急性肺损伤的干预，为中药治疗肺损伤提供理论基础。

1 实验材料

1.1 动物、试剂与仪器 36只8周龄雄性健康昆明种小鼠（广东省动物实验中心，合格证号：4407209314），体质量18～20 g。RNA提取及逆转录试剂盒（美国Promega公司）；脂多糖内毒素LPS（美国Sigma公司）；AQP5（上海生工公司）；肿瘤坏死因子αEL ISA试剂盒（武汉博士德公司）；半夏（广州军区广州总医院）。

1.2 半夏提取物制备 用水煎醇提法取0.5 kg法半夏，先用水煎煮2～3次，取浓缩滤液，再用95％乙醇反复过滤浓缩，制成50 mL半夏提取物，即每1 mL提取物溶液含10 g生药量。

1.3 急性肺损伤小鼠模型制备 将36只小鼠随机平均分为3组，分别为空白对照组（NS组）、肺损伤造模组（ALI组）、半夏提取物治疗组（EP组）。ALI组和EP组急性肺损伤小鼠模型制备参考文献［5］的制备方法，给予腹腔注射浓度为 200μg/mL的 LPS （10mg/Kg），空白对照组腹腔注射等量的生理盐水。EP组小鼠在造模前1周，每天以半夏提取物1.5 mL胃管灌服，1次/d，连用7 d。在造模后6 h时间点处死小鼠，立即解剖小鼠肺组织，左上肺进行湿重/干重比检测，左中下制作病理切片，行HE检查。右肺制成肺组织匀浆，采用PCR检测AQP5，同时取血清检测TNF-α浓度。

2 实验方法

2.1 肺湿重/干重比（W/D）的测定 取左上肺称湿重后，置70℃恒温箱，24 h后称干重，计算W/D比值。

2.2 肺组织HE染色片制备和观察 左中下肺组织经过10％的甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下观察急性肺损伤的病理变化。

2.3 EL ISA法检测小鼠中血清的TNF-α 回收的小鼠血液离心后取上清，采用酶联免疫法（ELISA）检测，严格按照试剂盒测定步骤说明进行。

2.4 肺组织AQP5 mRNA的表达检测 引物序列分别为：AQP5上游引物：GCGCTCAGCAACAACACAAC，AQP5下游引物：GTGTGACCGACAAGCCAATG，片段长度为 149bp；β-actin上游引物：CTGTCCCTGTATGCCTCTG，下游引物：ATGTCACGCACGATTTCC，片段长度为218bp；AQP5的PCR扩增条件：94℃变性55 s，53.5℃退火55 s，72℃延伸55 s，循环35次，72℃扩增5 min，β-actin的退火温度为53.5℃，其余条件相同。长波紫外灯下观察并照相，BioRad成像系统分析电泳条带，QuantityOne图像分析软件计算 AQP5 的mRNA与β-actinmRNA比值。

3 结果

3.1 肺组织肉眼观察 空白对照组及半夏提取物治疗组肺组织外观均无明显异常改变。肺损伤模型组肺体积增大，暗红色，表面可见大小不一散在红色斑点，切片疏松，可见淡红色液体渗出。

3.2 肺组织光镜观察 空白对照组及半夏提取物治疗组光镜下示肺泡结构基本完整，无明显异常。肺损伤模型组光镜下肺泡壁明显充血增厚，肺泡间隔增宽，腔内可见少许出血渗出、炎性细胞浸润，肺间质可见充血水肿，大量炎性细胞明显浸润（见图1）。

图1 HE染色结果

3.3 肺W/D比值 肺损伤模型组的肺W/D比值较对照组显著升高（P＜0.05），半夏提取物治疗组较肺损伤模型组（ALI）明显改善（P＜0.05），见表1。

表1 各组W/D比值的比较（±s，n＝12）

表1 各组W/D比值的比较（±s，n＝12）

注：与ALI组比较，＃P＜0.05

组别 W/D 比值NS组 4.508±0.217＃ALI组 6.337±0.491 EP组 5.370±0.984＃

3.4 RT-PCR检测小鼠AQP5mRNA的表达 见图2。

图2 PCR电泳结果

3.5 EL ISA检测小鼠血清TNF-α的表达 EL ISA结果显示，小鼠血清中TNF-α表达水平在模型组高于空白对照组（P＜0.05）；半夏提取物治疗组较模型组降低差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组AQP5mRNA的表达和血清TNF-α浓度的比较（±s，n＝12）

表2 各组AQP5mRNA的表达和血清TNF-α浓度的比较（±s，n＝12）

注：与ALI组比较，＃P＜0.05

组 别 AQP5mRNA TNF-α/（pg/mL）NS组 0.715±0.097＃ 264.37±21.38＃ALI组 0.450±0.081 735.13±28.17 EP组 0.583±0.074＃ 407.23±23.03＃

4 讨论

目前，研究表明肺水肿时肺脏的液体平衡破坏及通透性增高，与水通道蛋白（AQPs）密切相关。AQP5表达在气道分泌上皮顶质膜和肺泡Ⅰ型上皮细胞，主要的生理作用是清除肺泡腔内水分。AQP5特异性地转运水分子，其他溶质和分子则不能通过，保持血管与间质之间水平衡起到主要作用。内毒素刺激下大鼠肺组织AQP5表达水平明显下调，肺损伤严重，提示机体清除肺间质和肺泡腔过多水分的能力明显下降，肺泡-毛细血管膜水通透性显著降低［6］。

半夏是呼吸系统疾病的常用药［7-8］，其调节气道黏液分泌、减少肺部液体有独特的优势［9］，半夏提取物或复方半夏汤剂均发现可以调节AQP在肺组织内的表达，同时发现半夏可明显下调肺部炎症因子TNF-α等的表达［10］，但半夏是否能通过调节AQP来减轻或治疗急性肺损伤，目前尚不得知。

本研究发现肺损伤模型组小鼠W/D值较空白对照组明显增大，同时肺间质水肿AQP5表达明显下调，提示肺损伤造模成功。经半夏提取物预先治疗后，小鼠肺水肿明显改善，同时AQP5表达上调。炎症因子TNF-α的表达与AQP5表达结果正好相反，研究表明小鼠肺组织水分吸收障碍可能与AQP5表达下调相关。半夏提取物可通过提高AQP5的表达，提高肺间质水分的跨内皮转运，使水分子从肺间质回流到肺血管，加快肺泡水分的吸收，达到治疗急性肺损伤的目的。研究还发现半夏提取物在上调AQP5表达的同时，可明显下调血清TNF-α的表达。提示半夏提取物可能是通过抑制炎症介质释放如TNF-α，进而在基因水平上调AQP5的表达，以实现对肺损伤组织的保护。

［1］杨红娟，蔚京京，张卫红，等.血红素加氧酶-1对急性肺损伤大鼠水通道蛋白1，5表达的影响［J］.国际呼吸杂志，2014，34（2）：91-95.

［2］罗东，张家衡，柯有力，等.防己黄芪汤对兔肺缺血再灌注后肺水肿的保护作用［J］.吉林中医药，2014，34（8）：829.

［3］李竹英，王晶波.通腑汤对急性肺损伤大鼠肺组织中TGF-1的影响［J］.吉林中医药，2010，30（9）：811-812.

［4］邓青南，周建龙，郭振辉，等.半夏提取物对气道黏液高分泌的影响［J］.中国呼吸与危重监护杂志，2009，8（5）：477.

［5］JIAO G Y，LIE R，YU R J.Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lung in rats［J］.Chin MED J，2002（7）：963-967

［6］高巨，招伟贤，肖建斌，等.失血性休克-内毒素二次打击所致肺损伤水通道蛋白的表达［J］.中国急救医学，2007，27 （6）：546-548.

［7］王聪，史锁芳.史锁芳教授治疗急性病毒性上呼吸道感染发热的经验［J］.吉林中医药，2011，31（2）：103-104.

［8］韦麟.益肺止咳饮治疗慢性支气管炎急性发作50例［J］.吉林中医药，2011，31（6）：547-548.

［9］焦成芹.清气化痰丸加减治疗老年急慢性咳喘［J］.长春中医药大学学报，2010，26（6）：881.

［10］杨秀伟，韩美华，钟国跃，等.半夏中抑制肿瘤坏死因子-α产生的新脑苷［J］.中草药，2008，39（4）：485-489.

Effect on extracts of pinellia（EP）on expression of aquaporin 5 in m ice

ZHOU Jianlong，DENG Qingnan，LIANG Jing
（Guangzhou Military General Hospital，Guangzhou 510010，China）

Objective To investigate lung tissue aquaporin 5（AQP5）expression changes in acute lung injury（ALI）mice，and to explore the pharmacologicalmechanism of extracts of pinellia（EP）in the treatmentof acute lung injury.Methods 36 Kunmingmice were randomly divided into three groups，namely the blank control group（NS group），lung injury model group（ALIgroup）and pinellia extract treatment group（EP group）.After six hours，lung tissue wet/dry weight ratio（W/D）were observed and determined，lung tissue histopathological changeswere observed by HE staining，serum concentrations of TNF-αinmice were detected by ELISA and lung tissue AQP5 mRNA expressionswere detected by RT-PCR.Results Reflection of lung inflammation in mice in ALI group was significant，with main neutrophil infiltration as well asmarked alveolar edema and hyperemia.Lung inflammation in EPgroup was alleviated and the edemawas reduced.Compared with the NSgroup and EP group，W/D value difference was statistically significant in ALI group（P＜0.05）；Compared with NS group，AQP5mRNA expression decreased significantly and TNF-αin blood were higher in ALIgroup（P＜0.05）.Compared with ALIgroup，AQP5mRNA expression increased significantly and TNF-αin blood were lower in EP group（P＜0.05）.

Conclusion EP can reduce pulmonary edema by upregulating the expression of lung AQP5 which whosemechanism may be related with the inhibition of TNF-α.

lung injury；extracts of pinellia；aquaporin 5；mice

book=229,ebook=15

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0229－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.004

2014－10－28）

广东省中医药管理局基金（20131134）。

周建龙（1981－），男，硕士，主治医师，主要从事中西医治疗内科、肿瘤等疾病研究。