健骨伸筋汤对大鼠膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响

刘洪波，靖春颖通信作者：靖春颖，硕士，讲师，电话－5008060706，谢毅强，韩 平（.海南医学院中医学院，海口5799；.海南医学院附属医院中医科，海口5700）

健骨伸筋汤对大鼠膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响

刘洪波1，靖春颖1*通信作者：靖春颖，硕士，讲师，电话－15008060706，谢毅强1，韩 平2
（1.海南医学院中医学院，海口571199；2.海南医学院附属医院中医科，海口570102）

目的 探讨健骨伸筋汤对大鼠膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法 采用改良的Hulth法造模，造模2周后，开始对空白对照组、模型组生理盐水灌胃；对照组壮骨关节丸灌胃；治疗组分低、高浓度进行中药灌胃，第13周处死，通过免疫组化、TUNEL法检测软骨细胞的增殖与凋亡。说明健骨伸筋汤可以通过调节软骨细胞的增殖与凋亡防治骨关节炎。结果 健骨伸筋汤方含药血清各浓度组的软骨细胞增殖指数值明显高于对照组及模型组（P＜0.05），软骨细胞凋亡率明显低于对照组及模型组（P＜0.05）。结论 健骨伸筋汤可以促进软骨细胞的增殖，还可以抑制软骨细胞异常凋亡，从而起到防治骨关节炎的作用。

健骨伸筋汤；大鼠；膝关节软骨细胞；增殖与凋亡

健骨伸筋汤是治疗膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的经验方，经长期的临床运用及观察发现，健骨伸筋汤可减缓骨性关节炎发展［1］。骨关节炎是一种最常见的非化脓性、慢性骨关节病。临床上主要分为原发性和继发性［2］。主要表现为关节疼痛、僵硬、肿大、畸形及功能障碍，而且还常伴有继发性滑膜炎等疾病。中医中药在改善临床症状，提高患者生活质量方面［3-4］能起到很好的效果。

1 实验材料

1.1 实验动物 40只SPF级雌性健康4月龄SD大鼠，空腹体质量120～150 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司（许可证号：SCXK〔湘〕2009-0012）。

1.2 实验药品及试剂 健骨伸筋汤：由海南医学院药学院制备，按人与动物体表面积折算等效计量比值折算成大鼠生药量。浓缩含生药2 g/mL，4℃保存。DMEM培养基、胎牛血清FBS、Ⅱ胶原酶（Sigma，美国），购自海南绿叶生物制药有限公司。

2 实验方法

2.1 动物分组 40只雌性SD大鼠随机分为5组，每组8只：A组（空白对照组）、B组（造模组）、C组（壮骨关节丸组）、D组（健骨伸筋汤低剂量组）、E组（健骨伸筋汤高剂量组）。

2.2 造模方法 通过改良的Hulth法（取背侧切口切除双侧卵巢，再按照Hulth［5］法）：将大鼠麻醉后，仰卧于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨面，制成肾虚型大鼠的膝骨性关节炎模型。术毕无菌敷料包扎，不固定伤肢。术后每天每只大鼠肌肉注射青霉素 20万 U，共 1周。术后每天强迫大鼠活动30 min。2周后随机处死造模成功的1只大鼠，切取双侧股骨髁软骨处理后，电镜下观察，证实造模成功后进入实验研究。

2.3 给药方法 造模成功后，开始对空白对照组、模型组0.9％生理盐水灌胃；治疗组分低（含生药浓度20％）、高（含生药浓度80％）浓度进行中药灌胃（中药方剂：骨碎补、鹿衔草、丹参、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龙）。对照组：壮骨关节丸；大鼠剂量（mg/kg）＝系数（6.25）×人的剂量（mg/kg）［6］。

2.4 取材 全部动物在13周末处死，立即解剖右侧膝关节，锐刀片切取1 cm3大小股骨内髁全层软骨，置入无菌平皿，带入超净工作台。尖刀片削下每个关节表面的软骨，D-Hanks液充分漂洗后用眼科剪剪碎至1mm3大小，移至小锥形瓶中，加入0.25％的胰蛋白酶溶液于37℃搅拌消化15 min。1 200 r/min离心5min，去上清液，后加入0.2％Ⅱ型胶原酶5mL，置磁力搅拌器上37℃消化45 min。过滤，离心，吸弃上清，加入10％小牛血清的DMEM培养液混匀终止消化，并把细胞悬液稀释成（2～3）×105个/mL，接种于25 cm2培养瓶中，置CO2培养箱里常规原代培养及传代培养（温度37℃，饱和湿度，5％CO2，95％空气），用于RT-PCR检测［7］。

免疫组化检测软骨细胞增殖 行5μm厚的切片，常规脱蜡入水，双蒸水、PBS洗5 min×3次；20μg/mL蛋白酶K37℃消化15 min，PBS冲洗5 min×3次；3％ H2O2-甲醇中25 min，PBS冲洗5 min×3次，加入一抗（鼠抗人PCNA）37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次，加入二抗（生物素IgG）及链霉素-生物素-过氧化酶溶液30 min，PBS冲洗5 min×3次，SABC（1∶100）30min，PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，中性树胶封片。显微镜下计算阳性细胞所占比例（增殖阳性细胞黄色），随机检验10～15个视野，至少计数2 500个软骨细胞，算出增殖指数（增殖指数＝增殖率×100）。

TUNEL法检测软骨细胞凋亡 行5μm厚的切片，常规脱蜡入水，20μg/mL蛋白酶 K37℃消化15min，3％H2O2-甲醇中25 min，TUNEL反应混合液中37℃90min，5％羊血清室温封闭20 min，POD37℃孵育30min，碱性磷酸酶染色，中性树胶封片。算出凋亡指数（即每张切片选取5个阳性细胞数（细胞核中有棕黄色颗粒者）最多的高倍视野（×400），计算500个腺泡细胞中阳性细胞所占百分比）。

2.5 统计学方法 应用SPSS 17.0软件分析，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 免疫组化检测软骨细胞增殖 统计分析可知健骨伸筋汤高剂量组、低剂量组和壮骨关节丸组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明健骨伸筋汤高剂量、低剂量和壮骨关节丸对骨性关节炎模型关节软骨有修复作用；健骨伸筋汤高剂量组、低剂量组和壮骨关节丸组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明健骨伸筋汤高剂量组、低剂量组治疗效果优于壮骨关节丸组；健骨伸筋汤高剂量组和低剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明健骨伸筋汤高剂量组治疗效果优于低剂量组（见表1）。

3.2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡 凋亡的软骨细胞核呈棕黄色，主要分布在软骨的浅层和中层。空白对照组阳性细胞表达最低，健骨伸筋汤高剂量组、低剂量组和壮骨关节丸组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明健骨伸筋汤高剂量、低剂量和壮骨关节丸较好的抑制了软骨细胞的凋亡；健骨伸筋汤高剂量组、低剂量组和壮骨关节丸组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明健骨伸筋汤高剂量组、低剂量组抑制软骨细胞凋亡效果优于壮骨关节丸组；健骨伸筋汤高剂量组和低剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明健骨伸筋汤高剂量组抑制软骨细胞凋亡效果优于低剂量组（见表2）。

表1 健骨伸筋汤对大鼠软骨细胞增殖指数的影响（±s，n＝5）

表1 健骨伸筋汤对大鼠软骨细胞增殖指数的影响（±s，n＝5）

注：与模型组比较，＃P＜0.01；与壮骨关节丸组比较，△P＜0.05；与健骨伸筋汤低剂量组比较，▲P＜0.05

组别 增殖指数正常组 24.70±0.26模型组 17.78±1.87壮骨关节丸组 20.57±1.67＃健骨伸筋汤低剂量组 24.32±2.42＃△健骨伸筋汤高剂量组 33.13±2.42＃△▲

表2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡指数比较（±s，n＝5）

表2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡指数比较（±s，n＝5）

注：与模型组比较，＃P＜0.05；与壮骨关节丸组比较，△P＜0.05；与健骨伸筋汤低剂量组比较，▲P＜0.05

组别 凋亡指数正常组 3.70±0.26模型组 31.78±1.87壮骨关节丸组 21.57±1.67＃健骨伸筋汤低剂量组 19.32±2.42＃△健骨伸筋汤高剂量组 17.13±2.42＃△▲

4 讨论

骨关节炎是一种临床常见的老年人关节的退行性病变，发病率与年龄密切相关。国内膝骨关节炎流行病学［8］表明，65岁以上患有此病的女性和男性分别高达90％和80％。健骨伸筋汤包括五加皮、独活、威灵仙、苍术等中药，可舒筋活络，化湿通络，川芎、乳香、没药、红花、川牛膝、当归、赤芍强筋骨、祛瘀通经、消肿生肌；白芷、荆芥、防风祛风固表，温通散寒；木香、川乌头、草乌头行气止痛、消肿生肌，而上药熏洗、热敷，温通更有利于舒筋通络、温经止痛、强壮筋骨的功效，临床上能够有效改善关节活动度，促进关节功能康复。本实验结果表明，健骨伸筋汤方含药血清各浓度组的软骨细胞增殖指数值明显高于对照组（P＜0.05），说明其能促进软骨细胞的增生；而软骨细胞凋亡率明显低于对照组（P＜0.05），说明其具有抑制软骨细胞的异常凋亡的功效。

软骨损伤属于中医筋骨损伤范畴，现代研究认识到软骨细胞损伤，特别是软骨细胞凋亡与增殖平衡紊乱是其主要机制［9］。对KOA的研究应从膝关节软骨细胞着手，因为维持细胞外基质稳定的重要条件是正常的软骨细胞，KOA关节软骨退变的关键因素是细胞凋亡。软骨组织工程主要着手点是体外大量扩增种子细胞，然后种植到合适的生物支架中，对支架进行塑形，修复缺损。这就决定了软骨组织工程的三大要素是种子细胞、生物支架和生长因子［10］。为了给软骨组织工程的临床应用提供充足的种子细胞需尽可能开发新的、能够有效促进软骨细胞增殖并有效保持细胞表型的药物［11-12］。

本课题重点从软骨细胞凋亡与增殖的角度去探讨，经本2组实验结果研究表明：健骨伸筋汤具有促进软骨细胞的增殖的功效，还可以抑制软骨细胞异常凋亡，从而起到防治骨关节炎的作用。

［1］SANCHEZC，DEBERGM A，BELLAHCENE A，et al.Phenotypic charac-terization of osteoblasts from the sclemtie zones of osteoarthritic subehondral bone［J］.Arthritis Rheum，2008，58：442.

［2］HIGASHINO K，VIGGESWARAPUM，BARGOUTIM，et al.Stromal cell-derived factor-l potentiates bonemorphogenetie protein-2 induced bone formation［J］.Tissue Eng PartA，201l，17：523-530.

［3］李涛，张文雄，刘长虹.早期运动配合舒筋健骨汤在膝关节周围骨折术后的应用［J］.河北中医，2011，33（11）：1632.

［4］万春飞，詹秀琴，孙玉明.独活寄生汤含药血清对成骨细胞OPG/RANKL蛋白表达的影响［J］.吉林中医药，2013，33 （1）：66-69.

［5］葛鸿庆，薄智云.腹针疗法对膝骨性关节炎实验动物模型血清TNF-α及IL-1水平的影响［J］.新中医，2014，46（8）：178-179.

［6］杜力军，赵玉男.实验动物与实验动物模型［M］.北京：中国医药科技出版社，2012.

［7］王娇，崔洋，刘伟东，等.三氧化二砷对体外培养大鼠软骨细胞增殖和凋亡的影响［J］.哈尔滨医科大学学报，2013，47 （3）：220-223.

［8］陆艳红，石晓兵.膝骨关节炎国内外流行病学研究现状及进展［J］.中国中医骨伤科杂志，2012，20（6）：81-84.

［9］杜江，黄远鹏，李奕修，等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响［J］.中医正骨，2013，25（3）：11-20.

［10］刘献祥.中医药治疗膝骨性关节炎的研究现状［J］.中医正骨，2014，26（1）：3-7.

［11］雒焕生，李楠，王和鸣.中药对软骨细胞凋亡影响的研究进展［J］.中国中医骨伤科杂志，2010，18（3）：65-67.

［12］王艳丽，张旭，戴娟，等.慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达研究［J］.现代生物医学进展，2013，13（10）：1840-1843.

Effects of Jiangu Shenjin decoction on cell proliferation and apoptosis of rat's knee joint chondrocyte

LIU Hongbo1，JING Chunying1*，XIE Yiqiang1，HAN Ping2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；
2.The Affiliated Hospital to Hainan Medical University，Haikou 570102，China）

Objective To explore the effects of Jiangu Shenjin decoction on the cell proliferation and apoptosis of rat's chondrocyte.Methods By using improved Hulth method molding，after building 2 weeks，the blank control group and model group applying normal saline lavage；The control group using strong bone joints pill to lavage；Treatmentgroup using low and high concentration of Chinese traditionalmedicine to lavage respectively.On the 13 weeks executed，through immunohistochemistry and TUNELmethod to detect cartilage cell proliferation and apoptosis.Explain Jiangu Shenjin decoction can prevented and treatmentofosteoarthritis by adjust the cartilage cell proliferation and apoptosis.Results The increased index of all dosage of Jiangu Shenjin decoction were significantly higher than control group and molding group（P＜0.05），and the apoptosis rate of chondrocytewas significantly lower than control group andmolding group（P＜0.05）.Conclusion Jiangu Shenjin decoction can improve the cell proliferation activity and obstruct the abnormal apoptosis of chondrocyte，so as to prevent osteoarthritis from happening.

Jiangu Shenjin decoction；rat；chondrocyte of knee joint；proliferation and apoptosis

book=238,ebook=24

R285.5

A

2095－6258（2015）02－0238－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.007

辑：张海洋

2014－10－17）

海南省教育厅高等学校科学研究项目（Hjkj2011-29）。

刘洪波（1978－），男，硕士研究生，讲师，主要从事中医骨伤科学研究。