RecQ酵母解旋酶:DNA修复，基因组稳定性和衰老的线索

李星慧 秦娇琴 贾春媛 何本进 杜建财 杨帆 原慧萍 朱小泉 唐雷 孙亮 张毓洪 杨泽※

RecQ酵母解旋酶:DNA修复，基因组稳定性和衰老的线索

李星慧1，2秦娇琴2贾春媛2何本进2杜建财2杨帆2原慧萍2朱小泉2唐雷2孙亮2张毓洪1杨泽2※

RecQ酵母解旋酶 DNA 基因组 衰老

解旋酶是一类能解开核苷酸双链的酶，它广泛存在于从病毒到人类等多种生物体中。自1976年人类在大肠杆菌(Esherichia Coli E.coli)中发现了第一个解旋酶，至今已有上百种解旋酶被发现，而且这一酶家族成员还在不断扩大。经过多年的研究，人们发现解旋酶具有多种功能，在细胞内它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译、端粒稳定。最近，还发现个别解旋酶甚至参与机体天然免疫反应机制。DNA损伤修复机制是机体的重要防御机制，能及时修复环境中有害物质对机体造成的损害，避免损伤累计引起基因组不稳定性增加。

1．RecQ酵母解旋酶:基因组不稳定性和衰老的线索

细菌大肠杆菌RecQ DNA解旋酶是高度保守家族的创始成员之一，目前为止检测每一个物种同源基因鉴定都显示与RecQ酵母解旋酶同源。RecQ是RECF通路的一个重要组成部分，抑制不合理重组并介导停滞DNA复制叉中的DNA修复［1，2］。在人体细胞内至少有5种RecQ解旋酶:RECQ1，BLM (RECQ2)，WRN(RECQ3)，RECQ4和RECQ5，其中BLM，WRN，RecQ4基因突变可分别导致Bloom综合征(Bloom syndrome，BS)、Werner综合征(Werner syndrome，WS)和Rothmund-Thomson综合征(RTS)。这些疾病虽然在人类中都是极其罕见的隐性遗传病，但在分子水平都表现为基因组高度不稳定性、染色体异常(染色体断裂、缺失、重排、姐妹染色单体互换等)。这三种疾病发病率上升造成特定癌症临床上显示一些症状类似于过早老化。

虽然真核RecQ解旋酶确切的蜂窝作用尚不清楚，但正在摆脱简单真核生物如出芽和裂殖酵母的研究。在过去十年中，这些生物已经在多种细胞过程指出RecQ解旋酶的作用，包括DNA修复和复制、DNA损伤检查点、端粒维持乃至酵母老化过程。RecQ的作用在这些过程可以理解为解决异常DNA结构的能力。在芽殖酵母中SGS1是RecQ唯一的同系物，无论是在突变表型还是与其他蛋白质和细胞功能的交互方面SGS1和人类RecQ蛋白WRN和BLM之间存在明显的相似之处。

SGS1表型和WS与BS的表型之间有许多相似之处。Hyper-重组缺陷早已被公认为BS细胞的功能［3，4］。WS细胞表现超重组同源的DNA序列之间，从而导致GCR积累如易位和缺失。因此，在重组的缺陷方面，SGS1细胞显示功能类似于BS和WS细胞［5，6］。SGS1细胞超重组的表型为不合法的，同源重组是由BLM或WRN的表达抑制，这表明人类解旋酶可能和SGS1具有相似的功能。WRN缺陷细胞显示在S期和灵敏度对DNA损伤剂如喜树碱、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)和羟基脲缺陷［7］。像SGS1菌株WS成纤维细胞也显示在缺乏端粒酶端粒缺陷。目前尚不清楚WRN是否参与减数分裂，但不像BS患者，WS患者可以有后代。BLM定位于染色体的减数分裂在那里与RPA(复制蛋白A)相互作用［7］。

WS的早衰表型得到了很好的证明，患者显示了一些老化的特点和他们的性格被认为是模仿老年。同样在酵母，SGS1突变导致基因组不稳定性和DNA修复缺陷过早衰老的表型。SGS1细胞，裂殖酵母粟酒裂殖rqh1突变体在S期检查点是有缺陷的，有过敏反应羟基脲和UV，后者是BS细胞的一个标志［8，9］。在其他真菌物种突变表型指向真菌RecQ解旋其他角色中PI3-激酶介导的DNA损伤的反应，转录后基因沉默。令人吃惊的是单个基因的突变可引起表型的这种阵列。遗传证明指向DNA复制和减数分裂期间对于在检测和受损DNA或异常二级结构处理酵母真核RecQ解旋酶的作用。实际上，所有上述的表型至少可以存在于异常的DNA结构的解析缺陷部分。

2．结构、基底

Sgs1是迄今为止唯一在生物化学水平研究的低真核RecQ解旋酶。Sgs1容易在3’到5’的方向以ATP-dependent的方式展开标准双链DNA(dsDNA)基底。WRN和BLM还可以解决非标准DNA基底，包括合成霍利迪连接和G4 DNA。这些发现表明RecQ解旋酶可能是解决异常和有害的DNA二级结构或复合中间体。

DNA错配修复(MMR)之间避免不适当的复合过程是至关重要的相似但不相同的序列。MMR往往会导致缺陷的积累总染色体重组(颗粒)。在酵母，MMR是由各种错配修复蛋白复合物包括Msh2-Msh3，Msh2-Msh6，Mlh1-Pms1。Homeologous之间的重组DNA序列的研究已经确定了一个基因之间的联系，真核RecQ解旋酶和DNA错配修复蛋白。这些结果表明，Sgs1和Msh2功能独立通路抑制homeologous重组或者他们在相同的路径有冗余功能。在最近的一项研究中，Sgs1已被证明与Mlh1交互，尽管这种交互的功能意义尚不清楚［10］。

在酵母中表明结果，WS和BS可能的细胞中同源重组的抑制缺陷可依据核型异常和基因组不稳定性。SGS1和MMR之间的消除表明该BS和WS缺陷可能是在组织中，其中的MMR是限制性的更严重，这可能解释表征这些疾病散发肿瘤的光谱。也与酵母结果相一致，两者WRN突变细胞和大肠杆菌RecQ突变体显示重复序列之间缺失的频率增加。

与来自酵母的基因数据一致，哺乳动物BLM解旋酶已被证明是一个BRCA1相关的基因组监控复合，成为BASC一部分。所述BASC配合物包括MSH2，MSH6，MLH1(mismatch repair proteins)，ATM(ataxia telangiectasia mutated)，BRCA1 (breast cancer protein-1)，RMN复合RAD50-MRE11-NBS1(telomere/DNA break repair complex)，复制因子C和BLM［11］。所述SGS1-Msh1相互作用似乎已经进化上保守，因为BLM物理相互作用和共定位于hMLH1基因。有趣的是，如酵母和人类RecQ解旋酶的Msh2，MSH6和MLH蛋白质结合到合成的Holliday连接，这意味着它们可能参与的复制叉破坏重组修复。

3．Mgs1，酵母WHIP同系物

对于小鼠WRN相互作用蛋白的双杂种筛选中鉴定一种新的蛋白质指定WHIP(针对WS解旋酶相互作用蛋白)。WHIP显示部分同源的复制因子C(RFC)系列的装载PCNA/ Pol30p钳到引发的DNA模板DNA依赖的ATP酶。鼠鞭同源性与MGS1(维持基因组稳定性1)为酿酒酵母的蛋白质的45%。MGS1具有DNA依赖性ATP酶，单链DNA退火的活性和可能需要实现在诸如重组事件的正确DNA的拓扑结构。MGS1的缺失加剧了SGS1株(～6分裂)的寿命短，但部分缓解SGS1突变体的敏感性表明MMS灵敏度和寿命是可分的。菌株缺乏MGS1正常生长，并且不敏感。然而，单个细胞的平均寿命约为野生型细胞的75%，可能是在正常的生长条件MGS1不与SGS1途径起作用。然而，在DNA损伤的存在下，MGS1相同途径中Sgs1的上游作用与SGS1表观双重作用是一致的:抑制在正常条件下重组和过度DNA损伤的条件下，以诱导重组。一个有吸引力的假设是，在DNA损伤的存在下，SGS1的DNA链的分离活动联接到MGS1的DNA退火的活性。

4．拓扑异构酶与RecQ解旋酶

有证据表明RecQ解旋酶可以与拓扑异构酶协同破坏DNA分子。拓扑异构酶改变DNA超螺旋的复制、转录过程的程度和分解有丝分裂和减数分裂过程中产生共同的DNA分子。有两种类型的DNA拓扑异构酶，Ⅰ型拓扑异构酶作用于单链DNA的缺口，可以释放超螺旋DNA，而Ⅱ型拓扑异构酶可以使双链DNA断裂。在酿酒酵母中已经发现4种拓扑异构酶，3个存在于细胞核，1个存在于线粒体中。一些研究表明，SGS1与所有细胞核中的拓扑异构酶存在交互作用。细胞核中的拓扑异构酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ分别编码TOP1，TOP2和TOP3基因。酵母拓扑异构酶Ⅰ(Ⅱ型酶)是DNA复制，有丝分裂染色体集缩和一般转录抑制稳定期所需的［12］。TOP1的缺失对正常生长条件下生长速率或存活率没有影响。拓扑Ⅱ，另一Ⅱ型酶，需要交织在一起染色体的有丝分裂和减数分裂过程中，是存活在酵母中是必不可少的。拓扑Ⅲ是一种Ⅰ型酶，仅作用于负超螺旋单链DNA，可以使一个瞬时共价连接至切割的DNA和重组Top3的5’端。酵母菌株若缺乏TOP3基因生长极差，蓄积在G2/M期，对DNA损伤剂敏感，有严重的减数分裂缺陷和表现出重复序列，如端粒和rDNA的间超重组。

SGS1基因最初被鉴定为丧失功能的突变抑制拓扑异构酶Ⅲ(Top3)突变体的生长缓慢，并在酵母双杂交系统中无性繁殖与Top3的相互作用。SGS1和Top3之间的相互作用有DNA依赖性，在DNA中提高SGS1参与招募Top3的可能性。SGS1的缺失部分抑制超重组和Top3细胞减数分裂缺陷而不是它们对DNA损伤剂敏感。SGS1 TOP3细胞增长缓慢的抑制是通过BLM而不是WRN，这表明这种相互作用可能与BS更相关。SGS1和其他两个拓扑异构酶之间的相互作用被了解较少。SGS1也作用于拓扑异构酶Ⅱ(TOP2)交互件2-杂交筛选，表明两种蛋白质之间有物理相互作用。SGS1和TOP1之间遗传相互作用被观察到双突变体显示增长缓慢，虽然个别缺失对增长速度没有影响［13］。

RecQ解旋酶和Ⅰ型拓扑异构酶的相互作用似乎是非常保守的，殖酵母细胞缺乏TOP3+基因，使有缺陷的染色体在第一次减数分裂中分离死亡，致死性是通过删除rqh1+部分抑制。在人类中，BS解旋酶(BLM)物理上有两个Top3的同工酶，Top3α和RecQ5共同免疫沉淀两种Top3同工酶相互作用。酵母和部分TOP3突变体的缓慢生长缺陷通过异源表达hTop3β与SGS1相互作在保护Top3蛋白质之间的功能。SGS1和TOP1之间的遗传相互作用的生理意义是值得思考的问题。然而，有一些证据表明，这种相互作用存在于保守的人类。纯合子小鼠的WS胚胎干(ES)细胞显示在某些DNA修复系统表现出更高的突变率。人类细胞WS显示增强抗拓扑异构酶药物的敏感性。此外，在小鼠和人的研究表明，拓扑异构酶Ⅰ共免疫沉淀与WRN［14］。

5．RecQ解旋酶与Rad5

真核生物中同源重组的关键步骤通过Rad51-E.coli RecA的同源物催化。Rad51蛋白结合单链DNA并与同源双工保持一致，以促进它们之间的广泛链交换。现在有充分的证据表明哺乳动物RecQ解旋酶与Rad51蛋白存在进化保守的互动。BLM和RAD51直接通过残留在BLM的N和C端结构域相互作用。虽然WRN和RAD51没有被证明具有物理作用，但已经观察到二者共定位于DNA损伤的细胞。RecQ解旋酶和Rad51的之间进化保守的相互作用意味着这两类蛋白在共同执行DNA代谢过程中的重要作用［15］。

6．其他DNA修复基因

SGS1 SRS2合成生长缓慢/杀伤力遗传修饰已经确定。RAD50和MRE11通过非同源DNA末端连接(NHEJ)，基因转换和单链DNA退火(SSA)修复参与DNA双链断裂(DSB)，即RAD50和MRE11都为SGS1 SRS2菌株存活所必需。同样，对于SSA的基因，RAD1需要RAD59或MSH2，两个基因影响SSA的效率，也减少SGS1 SRS2突变体的活力，尽管比RAD50程度较轻，MRE11和RAD1缺失。这些结果可以通过一个模型，其中SGS1 SRS2细胞缺陷的同源重组，并使用DNA修复的替代SSA途径进行说明。这些SGS1 SRS2细胞试图进行DNA修复的同源重组难以完成的过程，并不能扭转它［16］。

该模型确认的基因数据表明该SGS1 SRS2双突变体的活力大大删去参与同源重组，即RAD51，RAD55和RAD57基因得到改善。该上位关系提出了SGS1在重组过程链侵入后发生的后续步骤中的作用。SGS1可能有促进重组中间体的成熟的作用，而Srs2p可能逆转，否则重组中间体流产。SGS1 SRS2双突变体在复制过程中形成的重组结构可能永远不会被解决，从而激活S期内检查点的细胞周期停滞和细胞死亡。

7．RecQ解旋酶的细胞功能

真核生物具有非常保守的检测点系统监控和回应DNA损伤或异常DNA结构作用。检测点对基因组的稳定性至关重要，因其可以延迟DNA复制和细胞周期进程的G1，G2或S期，直到DNA修复完成，发生机制至今尚未明确。哺乳动物细胞出现减缓复制叉的进展和延缓晚期复制起点延迟S期。毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)的PI3-激酶和hCHK2/CDS1激酶是该检查点通路的关键介质。酿酒酵母中有两个S期信号可以生成一个检测点。DNA损伤触发S期内部人类CHK2酵母同源的三个检查点信号，包括Chk1，MRE11和Rad53［17］，停滞的DNA复制叉通过Dun1激酶和DNA复制的一些原件，如PCNA和DNA聚合酶(POL 2)触发复制检测点。两个检测点需要酵母ATM同系物MEC1，TEL1是另一个酵母ATM同系物也起到了多重作用。

近来研究发现酵母RecQ解旋酶在S期内DNA损伤检测点发挥作用［18］。Western印迹几乎检测不到G1，SGS1，但在S期SGS1表达水平大幅度增加，部分是由于2个Swi4-Swi6细胞周期盒元件的存在，符合在DNA修复和检查点信号的作用。染色体重组(GCR)各种突变体的分析表明SGS1和RAD24在S期检测点和SGS1分支的多重作用主要是通过TEL1实现。这些研究也暗示Rad53起着在SGS1 S期内通路中的作用较小，但在RAD24通路中起主要作用。裂殖酵母紫外线和γ射线遗传反应分析表明rqh1+作用于酿酒酵母同系物Dun1-RAD9+的上游。与SGS1略微不同的Rqh1似乎调节S期检测点出口，而不是通过S期进展。研究表明，RecQ解旋酶的主要功能是检测DNA损伤和DNA复制过程中的问题，并引起的DNA损伤的反应，这与近期哺乳动物中遗传和生化研究结果是一致的。SGS1，BLM也在细胞周期调节表达，S期积累高水平G 1急剧下降［18］。BS细胞也显示γ射线诱导G2/M细胞周期检测点的部分缺陷和G1到S期早期UVC照射的高敏感度。哺乳动物的ATM激酶作用于肿瘤抑制基因p53的上游，以防止细胞周期进展，促进DNA修复和细胞凋亡。BLM和WRN与p53的C末端相互作用使p53介导的细胞凋亡衰减。细胞缺乏p53蛋白降低BLM在早幼粒细胞白血病(PML)核中的积累，招募其他细胞蛋白质的结构实体，如Rb(retinoblastoma protein)，SUMO-1(small ubiquitinrelated modifier-1)and UBC9(a SUMO-conjugating enzyme)。最近研究显示WRN与SUMO-1和UBC9的交互作用。

8．DNA复制和修复

真核RecQ解旋酶DNA的代谢涉及很多方面，包括解决异常DNA结构，抑制不合理重组和重新启动DNA复制，包围复制区别变得模糊，使研究变得困难。然而，明显的是RecQ解旋酶与DNA修复和复制相关有无数的通路起作用。

真核RecQ解旋酶三个复制功能已经被提出分别为:重启停滞复制、重组修复病变的停滞叉和解决异常DNA二级结构。SGS1与Rad53在S期共定位具体发病灶的证据表明，SGS1需要Rad53与染色质联合。Sgs1似乎在正常情况下抑制某些类型的重组，导致重组以应对DNA损伤状况。此外，遗传分析还表明SGS1和MSH2之间存在相互作用［19］。这些基因似乎在抑制同源重组独立的途径发挥作用。

已知某些蛋白质与SGS1相互作用可能推测出这些蛋白质解除异常DNA结构。已知蛋白质包括MGS1，单链退火蛋白，Rad51蛋白，其结合单链DNA与双链体DNA，解除双链DNA连接可能需要拓扑异构酶Top3，Top2，Top1。WRN与WHIP，Rad51蛋白和Top1相互作用，BLM与Rad51，Top3αWRN相互作用，BLM和SGS1解旋酶相互作用显示能够解除G4 DNA。这些DNA的结构可能在DNA复制过程中形成单链DNA，RecQ解旋酶解除复制的重新启动可能是至关重要的。

9．酵母RecQ与衰老

SGS1细胞的最近研究表明SGS1细胞寿命短是在复合两个独立的过程中:老化和随机死亡。SGS1和FOB1之间的上位性分析提供了充分的证据。删除FOB1，其编码一个rDNA的复制叉块蛋白，稳定rDNA和延迟ERCs的形成。FOB1缺失显著增加SGS1菌株的最大寿命，菌株缺乏SRS2也被证明是老化和随机死亡的结果。SGS1的SRS2菌株过表达抑制羟基脲和MMS的灵敏度提高寿命，但不是平均寿命。删除SGS1菌株的FOB1具有延缓衰老的效果。因此，SRS2株的增加，最长寿命也因老化的抑制没有显示出明显的DNA复制缺陷［20］。

大多数哺乳动物细胞类型可容易发现ERCs和其他环状DNA，尽管它们似乎与供体年龄或细胞传代次数不关联。然而，哺乳动物具有比酵母重复DNA的更多区域，如果ERCs检测这些位点将很难检测到，不仅是rDNA，衰老不是一个适应性的生物过程，因此不一定守恒。事实上ERCs限制酵母寿命表明基因组稳定性的维持对生物体的寿命至关重要，这可能适用于所有真核生物，基因组不稳定性可能根据生物体的生物学表现不同方式。

酵母RecQ通过遗传分析获得了巨大有用的信息。证实识别交互基因和参与DNA复制、修复和重组的通路，显示不同的基因和通路对生物NE.Cms_Insert体的基因组稳定性的相对贡献至关重要。RecQ解旋酶生化方面的功能、酵母模型已经在人类细胞培养完成。新的相关数据很可能进一步获得生化分析和Sgs1复合物的提纯。

尽管RecQ解旋酶大量的数据来自体外分析，结论类型有明显的局限性。生化研究表明，与其他蛋白质交互可能改变解旋酶的底物特异性和活动。此外，RecQ转录后修饰蛋白质磷酸化可以调节这些蛋白质的催化活性。只有走出仅有基因、细胞生物学和生物化学结合的研究才能描绘出完整的RecQ功能。真核RecQ蛋白质的功能大部分的猜测依靠原核生物线索。E.coli复制、修复和重组已经被广泛的研究，但是细菌和真核生物之间的根本差异限制模型的实用性。RecQ解旋酶，尤其是基因的相互作用酵母，确实被证明是一个有用的模型。Sgs1是唯一RecQ解旋酶在出芽酵母表明它可能执行多种功能。事实上，某些方面Sgs1功能更适用于BLM WRN。然而，酵母操控基因意味着可能会提供额外的WRN功能线索和其他人类RecQ解NE.Cms_Insert旋酶NE.Cms_ InsertNE.Cms_InsertNE.Cms_Insert。

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10.3969/j.issn.1672-4860.2015.05.002

2015-7-20

1.宁夏医科大学 750004 2.北京医院 100730

国家自然科学基金(81370445，81472408);卫生部行业基金(201302008);科技部十二五支撑计划项目(2012BAI10B01)

李星慧(1989-)，女，在读硕士研究生，研究方向为分子流行病学。※为通讯作者