老年退行性疾病中Caspase非依赖性细胞凋亡机制研究

贾春媛 张毓洪 孙亮 朱小泉 原惠萍 杨帆 李星慧 秦娇琴 杜建才 何本进 韩晶 张翻弟 杨泽※

老年退行性疾病中Caspase非依赖性细胞凋亡机制研究

贾春媛1，2张毓洪1※孙亮2朱小泉2原惠萍2杨帆2李星慧1，2秦娇琴2杜建才1，2何本进2韩晶2张翻弟1，2杨泽2※

细胞凋亡是一种程序化的主动的细胞死亡过程。一般认为它是由蛋白酶Caspase通过两种途径激活的。但最近的研究发现除了Caspase引起的凋亡外，还有Caspase非依赖性的细胞死亡形式存在。本文综述了近年来有关Caspase非依赖性细胞凋亡调控的研究进展。

细胞凋亡 非依赖性 Caspase

近30年前，Kerr和同事提出了一个内在的细胞死亡程序的存在，并对此程序引入术语凋亡［1］。细胞凋亡是一种程序化的主动性细胞死亡。与此相反，坏死是细胞“程序性死亡”的另一种形式，具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补”方式被采用。细胞死亡方式按照形态学标准分为凋亡和坏死:细胞凋亡的标志一般表现为膜出泡，细胞皱缩和染色质出现不可逆性凝集而坏死，通常与质膜完整性的早期损耗相关联，并且伴有细胞膨胀。在最近几年，凋亡细胞死亡机制的关键部件和在其中嵌入的识别信号通路的相关研究已经取得显著进展。人们普遍认为多数的细胞凋亡都是由蛋白酶Caspase介导的。许多年来，PCD是Caspase介导的细胞凋亡的同义语。然而，越来越多的研究证实了Caspase非依赖性PCD形式的存在。现今认为只有一个活性细胞死亡型的初始模型过于简化，因为这只是纷繁复杂的细胞程序性死亡机制中的一种形式。同时，某些PCD不需要激活Caspase。只需一个简单的执行系统，即Caspase，就可以很容易地克服被病毒转化的细胞。因此，在进化的过程中可能演变出另一种细胞死亡通路，作为备用。本文将关注目前业内人士对Caspase非依赖性PCD的理解。(细胞程序性死亡一词最初是为细胞死亡的发展而保留的，本文将PCD与细胞死亡活性互换使用。)

1．多种形式的PCD

虽然对于PCD的命名还存在较大争议，但在目前大多数文献中，术语“凋亡”专门用于胱天蛋白酶依赖的细胞死亡［2］。Leist and Jäättelä最近提出了一个不同形式的PCD［3］。这种分类是基于形态学和生化标准，除了被动坏死存在三种不同形式的PCD:①古典，与膜出泡，有效的染色质凝聚/碎裂，磷脂酰丝氨酸暴露，中断相关联的Caspase依赖性细胞凋亡小区到凋亡小体，胱天蛋白酶活化性裂解和间DNA裂解;②凋亡样PCD特征在于染色质凝聚不紧凑，磷脂酰丝氨酸暴露，但没有Caspase激活的裂解;③无论染色质凝聚或者Caspase激活，均不发生坏死样PCD。

除了以上三个分类外，还有不同种类的PCD。这些PCD仅存在于不同种的细胞内，包括类凋亡和暗细胞死亡［4，5］。还有一种类型为自噬PCD，这个过程首先在酵母中发现。在自噬作用中，其特征是突出细胞质空泡化，细胞成分经由自噬途径被降解导致了细胞被破坏。这里我们只讨论不同形式PCD的生化特性和遗传需求。

2．Bcl-2家族对Caspase非依赖性PCD的调控

刽子手Caspase的激活可以通过促凋亡因子从线粒体释放死亡受体后实现，这是由Bcl-2家族蛋白控制的途径。该途径发生于活化的启动剂Caspase-9通过衔接蛋白凋亡蛋白酶结合factor-1(Apaf-1)的Caspase募集结构域(CARD)。Caspase-9，Apaf-1和随后的凋亡体之间的关联是由促凋亡因子细胞色素C触发。该因子在线粒体膜间，参与电子传递呼吸过程。细胞凋亡过程中，细胞色素C从空间释放，因为在线粒体外膜渗透性显著增加。这个过程被触发，并且通过促和抗细胞凋亡Bcl-2家族蛋白的控制。然而，由于线粒体的PCD信号转导通路的中央整合等多种因素，会释放能量引发Caspase非依赖性细胞死亡。此外，线粒体能量改变直接导致细胞色素C的损失，从而引起细胞死亡。

2.1 酵母菌研究 现已初步研究了在裂殖酵母中的粟酒裂殖酵母Bcl-2家族蛋白和线粒体控制的Caspase非依赖性细胞死亡，酵母基因组中不包含任何蛋白酶。尽管如此，在粟酒裂殖酵母中，促凋亡Bcl-2家族成员Bax和Bak过表达已被证明可引起细胞死亡［6］。在酵母中Bax-和Bak诱导的细胞死亡与突出细胞质空泡化和核染色质凝聚相关联。此外，它可以通过Bcl-XL的抗凋亡活跃起来。这一观察结果可能表明，进化过程中Caspase非依赖性细胞死亡途径的出现比经典的Caspase依赖性细胞凋亡要早得多。事实上，早在细菌中就可以观察到PCD［7］。

2.2 基因改造的背景研究 在酵母一致性模型中，Bax和Bak蛋白的过表达能够诱导线粒体功能障碍引发的细胞死亡，由于缺乏Caspase-3，Caspase-9和Apaf-1，细胞内缺乏凋亡体介导的Caspase活性。此线粒体步骤需要Bax和/或Bak的活化，因为Bax蛋白/Bak的双敲除是完全缺陷触发的内在凋亡途径［8］。此外，公认的主要刽子手Caspase是Caspase-3，缺乏的Caspase-3的表达细胞代表一个经常使用的实验系统，该系统用于研究在细胞死亡过程中这个特别的蛋白酶的形态学和生化改变的相关性［9，10］。然而，细胞中虽然缺乏Caspase-3，细胞的死亡也不一定以Caspase非依赖性方式发生，因为其他凋亡蛋白酶Caspase如Caspase-6和Caspase-7可能部分地替代Caspase-3的活性。

3．蛋白酶抑制剂运用研究

酶活性的抑制是研究Caspase依赖性细胞死亡的另一种广泛使用的实验方法。所采用的Caspase抑制剂可能是生物(病毒或细胞蛋白酶抑制剂)或是化学品(合成肽酶抑制剂)。无论是针对个别Caspase，还是zVAD-fmk广谱抑制剂，各种肽酶抑制剂均参与了实验。zVAD-fmk是一种可渗透细胞的，不可逆pan-Caspase抑制剂，抑制细胞凋亡的全部特性，但不废除Caspase的活性。有人提出，没有任何单一实验系统中存在可以拯救细胞死亡的zVAD-fmk。这已经被证实并被用于多种细胞凋亡刺激和两个主要的细胞死亡途径:死亡受体途径(见下文)和线粒体途径。这些观察结果意味着在个体细胞接收到任何给定的凋亡性死亡信号时，二者的Caspase依赖性和Caspase非依赖性细胞死亡途径均被激活。尽管是以一种速度较慢，更有效的方式抑制Caspase活性，Caspase非依赖性细胞死亡的机制足以最终导致细胞死亡。虽然有活性的Caspase是细胞不执行凋亡的一个前提条件，但是时间框架和Caspase依赖性可能是单个细胞凋亡事件中的刺激因素，也属于细胞类型的特异性。例如，在膜出泡对Caspase活性的依赖性存在自相矛盾的数据。最近的两个报告描述的Caspase依赖性活化的丝氨酸/苏氨酸激酶，ROCK作为膜出泡的起始关键步骤［11，12］。另一方面，应用蛋白酶抑制剂的发现，一些在细胞凋亡早期，细胞质的改变不依赖于激活胱天蛋白酶。在由麦卡锡和同事进行的精浆蛋白研究中，细胞皱缩和膜出泡不被抑制通过与诱导细胞死亡后泛Caspase抑制剂活性的废除，这是因为受到多种刺激，包括致癌基因的过度表达和DNA损伤诱导的。在一个可供选择的细胞死亡途径中，死亡相关蛋白(DAP)激酶家族成员可能以Caspase非依赖性方式引发膜出泡。这些激酶的催化结构域共享一个高的肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的同源序列［13］。值得注意的是，肌球蛋白轻链的磷酸化(MLC)涉及到Caspase非依赖性膜出泡。尽管Caspase抑制剂可以显著改变细胞的死亡应答，但是这些抑制剂所观察到的效果必须进行严格讨论。尤其是所谓的“泛蛋白酶抑制剂”，如zVAD-fmk，是否能够完全抑制所有Caspase在细胞中的凋亡，还有待确定。化学蛋白酶抑制剂的最大缺点是其有限的稳定性和总的差异结合到个体Caspase家族成员的亲和力。此外，其他半胱氨酸蛋白酶(如钙蛋白酶和组织蛋白酶)还可以由这些化合物抑制，从而更加有力的解释实验数据。

4．细胞色素C的损失导致线粒体功能障碍

虽然许多研究都集中在细胞色素C释放的凋亡体激活的扳机作用上，但是细胞色素C的损失也可能直接影响线粒体自由基和ATP产生［14］。使用细胞色素C-GFP表达细胞共聚焦延时成像实验表明，细胞色素C在凋亡过程中的释放是迅速和完全的。细胞色素C常运输线粒体复合物Ⅲ和Ⅳ之间的电子。中断线粒体电子的流动引起细胞色素C的显著损失并在其降低的状态下，仍将保留络合物Ⅰ和辅酶复合体Ⅱ。这也是复合物Ⅲ和Ⅳ抑制剂的已知效应，以增加线粒体超氧化物的潜在机制。抑制线粒体电子流和增加线粒体超氧化物的产生继发于细胞色素C释放的Jurkat和HL60细胞［13］，这在Fast和星形孢菌素介导的细胞凋亡过程中已经观察到。有趣的是，细胞色素C释放和超氧化物的产量也出现在神经元营养因子退选或星形孢菌素诱导的细胞凋亡期间类似的死亡级联时间点上。此外，在细胞系均保留了线粒体呼吸(ρ-细胞)，细胞色素C释放和激活细胞凋亡，但无法检测到超氧化物生成增加。因此，线粒体源性ROS生成的上游可能会出现细胞色素C释放。抗氧化剂、超氧化物歧化酶模拟物以及超氧化物歧化酶的过表达在几个细胞凋亡模型的保护作用表明，由于细胞色素C的损失超氧化物的产生可能在细胞死亡的执行中起重要作用，特别是在非转化的细胞中。与此相反，抑制刽子手Caspase的降低，并不一定抑制细胞死亡。因此，线粒体超氧化物生成可能显著凋亡过程中向细胞死亡，特别是在敏感与氧化剂应激细胞类型。因此，线粒体超氧化物生成凋亡过程中可能显著促进细胞死亡，特别是对氧化剂敏感的应激细胞类型。线粒体在已经释放了细胞色素C后也同样能够产生少量的ATP。

线粒体可在细胞色素C释放后仍维持线粒体膜电位。证据表明，这是由一个反转的F0F1-ATP酶在反向模式下操作引起的，同时消耗ATP。离体线粒体细胞色素C的外膜渗透性增加同时恢复膜电位和ATP产量。证据还提供了线粒体能够通过胞质释放细胞色素C回线粒体内膜扩散后仍保持完整细胞的膜电位。然而，线粒体在释放细胞色素C后最终能够去极化，这个过程Caspase依赖于某些系统。线粒体去极化会导致ATP耗竭，伴随着离子平衡，细胞内Ca2+超载，最后细胞坏死的干扰。在培养的大鼠交感神经元中，通过蛋白酶抑制剂的作用失去NGF，细胞可以从细胞死亡被营救直至线粒体去极化。最近的研究表明，最后去极化的开口是通透性转换孔。

5．依赖性Bcl-2从线粒体中释放的其他因子促凋亡作用

还有替代的信号传导途径从而引起PCD相关凋亡事件，如染色体DNA的降解。其中之一是由凋亡诱导因子(AIF)，线粒体蛋白，执行PCD的过程中被释放到胞质溶胶介导的。AIF属于氧化还原酶的基因家族，最有可能参与蛋白酶独立细胞死亡，是迄今为止最好的研究基因产物。然而，不要求AIF的酶活性能够诱导细胞死亡。显然，当激活内在的细胞死亡途径，这两种Caspase依赖性(凋亡体/Caspase-3/CAD/ DFF-40)和Caspase非依赖性(AIF)执行路径可以同时触发，PCD期间可同时引起不同的能量爆发。对比CAD/DFF40，AIF诱导大规模DNA断裂，从而导致染色质浓缩。外周血染色质冷凝是早期古典凋亡的能量爆发。AIF的DNA的降解活性是Caspase非依赖性作为局部染色质溶解和引起核AIF细胞死亡，不会因为z VAD-FMK的存在而受到抑制。与此相反，Bcl-2的过度表达抑制了从线粒体AIF易位到细胞质，从而废除AIF触发的PCD。敲除研究表明，AIF可能在胚胎发育过程中控制早期形态。细胞性粘菌是最近已确定的AIF基因，能够诱导细胞死亡。这表明，基础性AIF的凋亡途径可能是进化早于Caspase依赖的死亡级联。

在某些情况下，间DNA裂解的规模化碎片也可能以Caspase非依赖的方式发生。在CAD/DFF-40敲除细胞的DNA梯状条带，诱导细胞死亡后可以观察到DNA裂解，尽管比起野生型细胞裂解程度较小。最近，一种新型的细胞凋亡酶D，核酸内切酶G，具有DNA加工的特点。就像AIF中，核酸内切酶G从线粒体释放并转移到细胞核的PCD中。

6．非依赖性Caspase细胞凋亡在死亡受体信号中的应答

由肿瘤坏死因子α(TNF)和Fas配体(FasL的)结合到其各自受体，在一定的实验条件下既可诱导古典凋亡同时可以诱导坏死样PCD［12，13］。此外，敲除研究显示，坏死样PCD由外在细胞死亡途径引发依赖于蛋白激酶受体相互作用蛋白(RIP)的两个Fas相关死亡域(FADD)介导的活化。有趣的是，这种类型的细胞死亡结果表明要求的RIP酶活性是可有可无的核因子KB(NF-κB)的RIP介导的活化。尽管死亡受体介导性坏死分子机制的特点仍不明显，线粒体功能异常，和非Caspase似乎是这一过程至关重要的部分。在z VAD-fmk的存在下，死亡受体介导性坏死需要线粒体步骤，虽然没有观察到裂解，也没有细胞色素C的释放。相反，这种类型的坏死样PCD与ROS增加的线粒体具有关联性。从线粒体中诱导TNF的PCD释放ROS和抗氧化剂抑制这种形式的细胞死亡。

7．Bcl-2家族成员的坏死对照

Bcl-2家族互动成员BNIP3，通过诱导线粒体通透性转换坏死样细胞死亡。BNIP3引发的细胞死亡与BNIP3易位至线粒体外膜，线粒体膜电位损失和活性氧(ROS)的产生增加相关联。然而，BNIP3介导的细胞死亡是非依赖性Apaf-1，活化蛋白酶和细胞释放色素c。它已经表明Bcl-2的发挥了它由BNIP3与复合物形成的抗坏死作用。

8．非Caspase参与的PCD

除了半胱氨酸蛋白酶，其他如丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶和钙蛋白酶也可能参与PCD。一般丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF已经在大鼠成纤维细胞中显示出抑制癌基因驱动的PCD。颗粒酶A和B与由T淋巴细胞颗粒介导的细胞毒作用引发的Caspase-独立细胞死亡途径有关。然而，颗粒酶B诱导的细胞死亡是通过废除Caspase活性的延迟。相比之下，一个触发颗粒酶Caspase非依赖性细胞死亡通过激活核酸内切酶颗粒酶A-激活的DNA酶(GAAD)，导致单链DNA切刻和染色质浓缩。另一个最近确定的丝氨酸蛋白酶HtrA2，这是从线粒体PCD过程中释放，同时激活Caspase依赖和Caspase非依赖性细胞死亡途径。通过HtrA2触发Caspase非依赖性细胞死亡取决于其酶活性。组织蛋白酶家族的两个成员包括组织蛋白酶B、D，溶酶体蛋白，已经提出在PCD中易位到细胞质。在一定条件下组织蛋白酶B可成为死亡受体诱导PCD的主导执行蛋白酶。最近提出了另一个组织蛋白酶家族成员D与PCD的相关作用。类似于颗粒酶B，组织蛋白酶参与裂解和活化。

有多项研究表明，特定钙蛋白酶抑制剂可以在许多情况下抑制PCD。有趣的是，钙蛋白酶促进血小板活化和兴奋性神经元死亡，包括染色质凝聚，磷脂酰丝氨酸暴露，Caspase基片切割和细胞收缩过程中的凋亡样事件，从而模仿Caspase介导的细胞凋亡方面。因此，钙蛋白酶在候选的凋亡样PCD当中执行。细胞内Ca2+凋亡过程中浓度升高，例如，线粒体功能障碍可能导致PCD相关，如钙蛋白酶或死亡相关蛋白(DAP)的激酶的活化。像Caspase，钙蛋白酶是一类胞质半胱氨酸蛋白酶，但需要钙离子增加它们的活性。钙蛋白酶的活化可以通过内源性钙蛋白酶抑制剂钙蛋白酶抑制蛋白放大蛋白酶裂解位。有研究认为钙蛋白酶参与Caspase活性凋亡过程中的调节。已描述过上游Caspases-9和Caspases-8，以及处决Caspases-3和Caspases-7由钙蛋白酶的切割位。钙蛋白酶切割的促Caspases-3和Caspases-9仍然可以通过颗粒酶B激活。另一方面，一些报告支持钙蛋白酶Caspase活性的负调节剂的作用。钙蛋白酶产生的碎片Caspases-7，Caspases-8，Caspases-9没有活性，可能无法激活下游的Caspase刽子手，和钙蛋白酶有效抑制细胞色素C激活Caspases刽子手的能力。最近的一项研究也证明了细胞色素C与Apaf-1依赖。因此可以想象，钙蛋白酶的上游或伴随活化发挥对Caspase活化的负反馈信号。

9．致癌性转化:从PCD逃生

PCD的基本功能之一是保护人类远离癌症。尽管原癌基因驱动型PCD的机制研究仍是个迷，但是许多致癌基因，包括c-Myc，E2F和Rays已被证明可在非转化的细胞中诱导PCD时过表达。重要的是，Caspase依赖性和Caspase非依赖性细胞死亡均会在肿瘤细胞恶性转化过程中回避。与此相反，c-Myc同时触发Caspase依赖性和Caspase非依赖性细胞死亡途径。肿瘤细胞抑制的PCD由增强抗凋亡信号传导途径或肿瘤抑制基因的失活来实现。有研究证明生存素可以保护肿瘤细胞的古典凋亡和Caspase非依赖性的PCD。组成型活性的突变体Akt/蛋白激酶B(PKB)最近已经涉及抑制Caspase非依赖性的PCD。在这项研究中，神经酰胺触发细胞死亡发生在z VAD-fmk的存在和Bcl-XL在神经胶质瘤细胞的过表达。然而，这种类型的PCD可以由主导活性的Akt/ PKB突变来抵消。肿瘤抑制因子PML和Bin-1丧失功能可能会牵连到Caspase独立细胞死亡的废除。肿瘤抑制因子PML参与诱发各种已知可激活经典Caspase依赖性细胞凋亡刺激的细胞死亡。此外，最近已承认PML的P53-共激活因子功能。然而，PML触发细胞死亡不需要激活Caspase与z VAD-fmk甚至可增强诱导的PML细胞死亡［14］。c-Myc的Caspase无关信号似乎需要Bin-1。突类似于突变型的Ras，z VAD-fmk或Bcl-2也不能拯救PCD诱导Bin-1过表达。然而，Bin-1引发的DNA降解通过抑制丝氨酸蛋白酶而废止。原癌基因驱动型Caspase非依赖性细胞死亡的执行可能涉及其他的Caspase，如组织蛋白酶和钙蛋白酶。

10．展望

Caspase非依赖性细胞死亡途径的发现增加了我们对PCD机制演化的了解，还需要寻找与PCD失调相关疾病治疗的新方法，例如癌症、缺血性和退行性疾病等。Caspase活性抑制剂Bcl-2家族蛋白具有很大的潜力，可以作为抗癌药物的开发方向。这些新的抗癌药物有利于增加线粒体外膜的渗透性，从而调控细胞内的死亡通路。还有一些前面提到的药物用于激活Caspase非依赖性死亡程序。另一方面，胱天蛋白酶、钙蛋白酶和组织蛋白酶抑制剂和抗氧化剂均有利于治疗缺血性和退行性疾病的PCD组分。更深层次的动物实验和人体试验将揭示这些创新疗法的有效性。

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Caspase-independent cell death in aging degenerative diseases

(JIA Chunyuan1，2，ZHANG Yuhong1※，SUN Liang2，ZHU Xiaoquan2，YUAN Huiping2，YANG Fan2，LI Xinghui1，2，QIN Jiaoqin2，DU Jiancai1，2，HE Benjin2，HAN Jing2，ZHANG Fandi1，2，YANG Ze2.1.Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China;2.Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing Hospital，Beijing 100730，China)

Apoptosis is an active form of cell death enabling individual cells to commit suicide.Which it is generally considered by the protease Caspase activation via two pathways.However，an increasing number of studies substantiate the existence of Caspaseindependent forms of PCD.This paper reviews the research progress of the Caspase-independent apoptosis regulation in recent years.

apoptosis，independent，Caspase

10.3969/j.issn.1672-4860.2015.05.010

2015-8-3

1.宁夏医科大学公共卫生学院 750004 2.北京医院 卫生部北京老年医学研究所 100730

国家自然科学基金(81061120527，81370445，81472408，81400790);卫生部公益性研究基金(201302008);国家科技部十二五支撑计划(2012BAI10B01);北京市科技新星计划(Z121107002512058)

贾春媛(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向为遗传流行病学。※为通讯作者