肝星状细胞对VEGF介导的脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化的影响

周春光，段文彪，赵延荣，李仓，孙克龙，张谊，单云峰，张启瑜

组织工程和再生医学的兴起使很多组织坏死性疾病有望得到治疗和治愈[1]。干细胞作为组织工程中种子细胞的主要来源，对其在分化上的研究一直是组织工程领域的研究热点[2-4]。大量研究[5-6]证明VEGF能促进ADSCs及其他干细胞向ECs分化。探索如何寻求有效的途径使去肝脏细胞化支架再细胞化，以获得具有不完全肝功能的肝样组织甚至具有完整血管网络的再细胞化肝脏一直是肝脏再生医学研究者们不懈努力的目标。本研究通过大鼠肝间质细胞—大鼠肝星状细胞与大鼠脂肪间充质干细胞，在内皮细胞分化诱导培养基中的间接共培养，观察在VEGF诱导下，HSCs对rADSCs向ECs分化的影响，为之后两种细胞在去细胞化支架内直接有序的共培养获取再细胞化肝脏提供研究策略。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝卵圆细胞WB-F344购自中科院上海细胞库；戊巴比妥钠、IV型胶原酶、Triton X-100购自Sigma公司；PBS购自Hyclone公司；FBS、DMEM/F12、DMEM、0.25% EDTA胰酶购自Gibco公司；vWF一抗、eNOs一抗和VE-Cadherin（CD144）一抗、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor®594）荧光二抗、Donkey Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor®488）荧光二抗购自Abcam公司；APC-CD90、Mouse IgG1（κPurified）、Mouse IgG1（κAPC）、Matrigel基质胶购自BD Biosciences公司；Goat anti-Mouse IgG H&L-HRP、Goat anti-Rabbit IgG H&L-HRP购自Bioworld公司；Transwell共培养小室购自Corning公司；CCK8试剂盒购自Dojindo公司；ECM培养基购自ScienCell公司；rVEGF购自PeproTECH公司；BCA试剂盒购自Beyotime公司；乙酰化低密度脂蛋白（DiI labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）购自YiYuanBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠脂肪间充质干细胞（rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，rADSCs）的分离和培养：选取6周龄SPF级雄性SD大鼠两只，2%戊巴比妥钠0.3 mL/g腹腔注射麻醉，无菌条件于大鼠后腹膜及肾周处取出多块体积约为1 mL左右的脂肪块经PBS冲洗后置于无菌培养皿内，迅速转移至超净台用无菌眼科剪将脂肪块剪碎，分别放入15 mL离心管内，加入4 mL含有0.075% IV型胶原酶的DMEM/F12培养基，于37 ℃下震荡消化60 min，200目无菌筛网过滤消化物，滤液经1500 r/min离心10 min收集细胞，用含有15% FBS的DMEM/F12培养基重悬，以1×105的密度种于25 cm2培养瓶内，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，1 d后换液。以后每两天换液一次，待细胞融合至培养瓶底80%时用含0.25%EDTA的胰酶消化传代。

1.2.2 rADSCs表面标记物的鉴定：取第三代rADSCs，胰酶消化制成单细胞悬液，离心PBS重悬，以每管1×106分装细胞，用APC直接标记的CD90和IgG H&L Alexa Fluor®488间接标记的CD144（VE-Cadherin）对rADSCs进行表面标记物的鉴定，以Mouse IgG1（κPurified）和Mouse IgG1（κAPC）作同型对照。1.2.3 共培养条件下诱导rADSCs向内皮细胞（endothelial cells，ECs）分化：利用膜孔径0.4μm的Transwell共培养小室，下层以1×104/孔的rADSCs在含有15% FBS的DMEM/F12培养基中培养，上层分别以1×103、1×104、1×105/孔的HSCs在含有5%FBS的DMEM培养基中培养，共培养2 d后，CCK8法测定下层rADSCs活力，选择rADSCs活力最好的组作为诱导培养的细胞比例。以之前确定的共培养细胞比例在Transwell共培养小室内，用内皮细胞诱导培养基替换DMEM/F12培养基后诱导rADSCs向ECs分化。内皮细胞诱导培养基成分包括：ECM（Endothelial Cell Medium）、5% FBS、pen/strep、ECGS（endothelial cell growth supplement）、10 ng/mL rVEGF。每2 d换一次诱导培养基，重新消化接种特定数目的HSCs，观察下层rADSCs诱导7 d和14 d后的形态学改变。诱导2周后收集各组诱导后的rADSCs，扩增、冻存备用。共培养实验设置四组，阳性对照组为大鼠脑微血管内皮细胞（rat Brain microvascular en-dothelial cells，rBMVECs）；实验组为HSCs与rADSCs在内皮细胞分化诱导培养基中共培养；阴性对照组为肝卵圆细胞（hepatic oval cells，HOCs）与rADSCs在内皮细胞分化诱导培养基中共培养；空白对照组为rADSCs在内皮细胞分化诱导培养基中单独诱导培养。培养及诱导后所得内皮细胞分别记为：阳性对照组，rBMVECs；实验组，（rADSCs+HSCs）ECs；阴性对照组，（rADSCs+HOSs）ECs；空白对照组，（rADSCs）ECs。

1.2.4vWF、eNOs、VE-Cadherin免疫荧光染色：诱导2周后，用内皮细胞特异性标记抗体—vWF、eNOs和VE-Cadherin鉴定诱导后rADSCs的表型。简要步骤为将已爬好rADSCs细胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定爬片15 min，0.5% Triton X-100室温通透20 min，驴血清室温封闭30 min，加足够量的稀释好的一抗在湿盒中4 ℃孵育过夜；第二天用PBS浸洗爬片3次，加稀释好的荧光二抗（Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor®594）或Donkey Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor®488，Abcam）在湿盒中37 ℃孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min进行核染，PBS洗去多余的DAPI，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.5eNOs蛋白表达检测：取诱导2周后的rADSCs细胞，提取细胞蛋白；BCA试剂盒测蛋白浓度，计算上样量；制8%和10%的SDS-PAGE胶，以60 mv跑胶，至样品进入分离胶后改为110 mv恒压电泳；以350 mA恒流转膜80～120 min；用5%脱脂奶粉封闭1 h，加稀释好的一抗（vWF、eNOs和VE-Cadherin）在湿盒中4 ℃孵育过夜，TBST洗三次后，加5%脱脂奶粉配制好的二抗（Goat anti-Mouse IgG H&L-HRP和Goat anti-Rabbit IgG H&L-HRP），常温孵育1 h后，于暗室中加发光剂发光、曝光。

1.2.6 功能学检测

（1）细胞迁移试验：取诱导2周后的rADSCs细胞，用无血清ECM培养基重悬细胞，在膜孔径8μm的Transwell小室（Corning）上层加入200μL细胞悬液（细胞浓度1×105/mL），在小室下层加入600μL含5% FBS和20 ng/mL rVEGF的ECM养基，培养24 h后取出上层小室，用干净的棉签轻轻拭去小室底部膜上层的细胞，最后把小室底部的膜轻轻取下，并把膜的底面朝上，用4%多聚甲醛固定15 min后，DAPI染色5 min，在荧光显微镜下观察穿过膜的细胞。

（2）DiI-Ac-LDL吞噬试验：诱导2周后在小室下层的诱导培养基中加入25μg/mL乙酰化低密度脂蛋白（DiI labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL），37 ℃继续培养4 h后用PBS清洗细胞3次，用4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染色5 min，在荧光显微镜下观察细胞DiI-Ac-LDL的吞噬情况。

（3）体外成血管试验：取诱导2周后的rADSCs细胞，用无血清ECM培养基培养12 h后，用诱导培养基制成细胞悬液，以1×105/孔加入到铺有Matrigel基质胶的24孔板中，置于37 ℃、5% C02的细胞培养箱中培养，24 h后观察细胞成血管情况。

1.2.7 统计学分析：用统计软件SPSSl9.0进行统计分析，计量资料用（±s），多组间差异比较采用单因素方差分析TuKey HSD方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代rADSCs的表面标记物鉴定

由大鼠脂肪组织提取的原代rADSCs经过传代培养后逐渐纯化，流式细胞技术检测结果（图1）显示第3代rADSCs表面标记物CD90阳性率达96.0%，CD144阴性率达93.1%。

2.2 共培养诱导体系初始细胞比例的确定

图1 rADSCs细胞表型分析

共培养体系中各种细胞比例对目的细胞的生长增殖有重大影响，因此确定最优的共培养初始细胞比例是十分必要的。我们分别以1×103、1×104、1×105/孔的HSCs和1×104/孔的rADSCs进行最优共培养初始细胞比例的探索，诱导培养2d后测定下层rADSCs细胞数，结果（图2）显示在HSCs为1×104/孔时，下层rADSCs生长相对最好（P＜0.05）。配合光镜下对细胞形态的观察，我们确定以1×104/孔HSCs和1×104/孔rADSCs作为共培养诱导体系初始细胞比例。注意到所用HSC-T6的增殖速率明显高于原代提取的rADSCs，当上层HSCs细胞量过高时（以1×105/孔培养2 d后），共培养体系中营养消耗过快，影响下层rADSCs生长，我们确定每两天换一次诱导培养基，重新消化接种特定数目的HSCs。

2.3 rADSCs诱导后形态学的变化

原代提取的rADSCs呈梭形或多边形，细胞融合至70%～90%后呈旋涡状生长。诱导后的rADSCs形态逐渐变短变圆，随着诱导时间的延长，越来越多的细胞出现内皮细胞典型的鹅卵石样改变。

图2 共培养诱导培养2 d后3种共培养体系rADSCs生长情况比较（*P＜0.05）

2.4 诱导后rADSCs免疫学指标的变化

图3HSCs共培养诱导第0、7和14天rADSCs光镜下细胞形态（×100）

图4 诱导2周后各组细胞vWF和VE-Cadherin免疫荧光双染，DAPI染核（蓝色），rBMVECs为阳性对照（×200）

图5 诱导2周后各组细胞eNOS和VE-Cadherin免疫荧光双染，DAPI染核（蓝色），rBMVECs为阳性对照（×200）

免疫荧光检测结果（图4、5）显示，四组细胞vWF和VE-Cadherin表达均阳性；阳性对照组和实验组eNOS表达强阳性，阴性对照组和空白对照组eNOS表达弱阳性。Western blotting检测结果（图6、7）与免疫荧光结果一致，实验组eNOS蛋白表达（0.71±0.06）明显高于阴性对照组（0.39±0.07）和空白对照组（0.44±0.05）（P＜0.05），eNOS/GAPDH灰度比值如图6所示。

图6 诱导2周后各组细胞eNOS蛋白表达情况，rBMVECs为阳性对照

2.5rADSCs诱导后功能学指标的变化

图7 诱导2周后各组细胞eNOS/GAPDH灰度比值，rBMVECs为阳性对照（*P＜0.05）

2.5.1 细胞迁移试验：正常的内皮细胞在趋化因子的作用下会显示出其定向迁移的能力。我们以FBS和VEGF作为趋化因子，检测诱导所得ECs的定向迁移能力。结果（图8、9）显示，四组细胞在FBS和VEGF作用下均可以在Transwell小室内发生透膜迁移，实验组每视野下细胞迁移数目（28.50±3.10）明显高于阴性对照组（16.25±2.06）和空白对照组（16.50±1.73）（P＜0.01）。

图8 诱导2周后各组细胞透膜迁移情况，以DAPI染核（蓝色）记数透膜细胞，rBMVECs为阳性对照（×200）

图9 诱导2周后各组细胞透膜迁移能力比较，rBMVECs为阳性对照（**P＜0.01）

2.5.2 DiI-Ac-LDL吞噬试验：对DiI-Ac-LDL的吞噬能力是内皮细胞具有的特性之一，通过检测诱导所得ECs对DiI-Ac-LDL的吞噬能力，可以反映内皮细胞的成熟程度和功能状态。实验结果经IPP软件处理测量后，以每视野下IOD（integrated optical density，积分光密度值）反映细胞对DiI-Ac-LDL的吞噬能力。结果显示（图10、11），四组细胞均能不同程度的吞噬DiI-Ac-LDL，实验组细胞（7383.00±1779.81）吞噬DiI-Ac-LDL的能力明显高于空白对照组（3337.25±617.14）（P＜0.05）。

2.5.3 体外成血管试验：成熟的内皮细胞具有在Matrigel胶上形成血管网络的特性，我们将诱导所得的ECs加入到铺有Matrigel基质胶的24孔板中，观察其成血管的能力。实验结果经IPP软件处理测量后，以每视野下小管总长度（像素）反映细胞的成血管能力。结果显示（图12、13），四组细胞均能形成血管样网络结构，实验组细胞（5476.25±826.03）体外成血管的能力明显高于其他三组细胞—阳性对照组（4153.5±547.16）（P＜0.05）、阴性对照组（3534.25±343.42）和空白对照组（4181.18±948.88）（P＜0.01）。

图10 诱导2周后各组细胞DiI-Ac-LDL（红色）吞噬情况，DAPI染核（蓝色），rBMVECs为阳性对照（×200）

图11 诱导2周后各组细胞DiI-Ac-LDL吞噬能力比较，rBMVECs为阳性对照（*P＜0.05）

3 讨论

组织工程技术被认为是最终能解决器官衰竭的途径。然而，功能性组织器官及其生物模拟物的设计和创造，特别是像肝脏这种具有复杂生物学功能的巨大实质性脏器，是一个十分复杂的过程。组织工程支架的内皮化和血管化是构建需要血液灌注的实质性脏器的必要环节。Basak E等[7]利用内皮细胞和肝细胞再细胞化大鼠去细胞化肝脏支架获得了具有一定肝脏功能的大鼠再细胞化肝脏，并成功将得到的肝脏移植回大鼠体内。然而内皮细胞并不容易获得，而ADSCs来源丰富，容易采集，不存在伦理争议[8]，大量研究[9-10]显示，ADSCs能在特定条件下向多种成熟细胞分化，包括内皮细胞、肝细胞系等。ADSCs已经被众多学者作为种子细胞应用于再生医学的研究，Nuness等[11]成功利用脂肪来源的血管基质细胞（adipose-de-rived SVF cells）和HepG2细胞系[hepatocyte cell line（HepG2）]设计出具有功能的血管化肝脏组织模拟物，虽然Nunes等认为他们的SVFs在表型上与其他人报道[9，12]的ADSCs有所差异，但他们的研究结果均证明ADSCs在向内皮分化和促进组织血管化方面均有巨大的潜能，这为ADSCs在组织工程方面的应用提供了巨大的可能。因此我们选择rADSCs进行肝脏组织器官内皮化和血管化的研究，我们的实验结果再次证明rADSCs在VEGF的诱导下能向内皮细胞分化，并表现出成熟内皮细胞的表型和功能。

图12 诱导2周后各组细胞成血管情况，rBMVECs为阳性对照（×100）

图13 诱导2周后各组细胞成血管能力比较，rBMVECs为阳性对照（*P＜0.05，**P＜0.01）

肝脏完整功能的行使关键在于肝脏的完整结构和完整的细胞成分。因此在构建功能性肝脏组织器官及其生物模拟物时，多细胞组织器官的多向分化诱导或者共培养便成为必须实现的一步。研究显示HSCs与肝细胞共培养能促进促进肝细胞形成类肝组织球状体，并且形成内皮化管腔。Abu-Absi等[13]在3D培养基中利用HSC-T6和肝细胞直接共培养模拟肝脏组织再生过程，获得的类肝组织球状体具有白蛋白分泌功能，并且具有内皮化管道。Kasuya等[14-15]在（D，L-lactide-co-glycolide）PLGA多聚微孔膜上利用小肝细胞（SHs）-肝星状细胞（HSCs）-内皮细胞（ECs）进行3D培养以获得具有功能的血管化肝脏组织，他们发现HSCs能促进ECs形成毛细血管样结构，并增强SHs的肝细胞样功能。细胞共培养对rADSCs细胞的分化成熟也有重要作用。Zhao等[9]认为ADSCs与成熟细胞的共培养能促进和增强ADSCs的定向分化。我们利用HSCs与rADSCs的间接共培养发现，在VEGF诱导下的HSCs可以促进rADSCs向ECs分化，并增强分化后ECs的细胞功能，特别是成血管能力的增强。另外，我们发现与实质性细胞（HOC，肝卵圆细胞-肝脏实质性细胞的一种）相比，非实质性细胞（HSCs-肝脏非实质性细胞的一种）更能促进rADSCs向ECs分化和分化后ECs功能的成熟。

比起细胞直接接触共培养获得功能性、血管化肝脏组织类似物，利用Transwell小室进行rADSCs和HSCs的间接共培养的一个优点便是能更加容易控制共培养体系中HSCs的细胞比例，从而能更加方便准确的观察测定在共培养过程中，rADSCs发生的生物学改变，阐明共培养条件下rADSCs发生相应改变的可能机制。在生物形态发生上，Durdu S[16]等认为很多细胞，如上皮细胞和胚胎干细胞，都具有自发形成多细胞中央腔的特性，在这个中央腔形成的微环境中，细胞间的信号交流变得更加高效，中央腔周围的细胞联系得更加紧密，这在对多细胞生物组织器官的发生和形成过程中具有重要作用。生物形态发生机制的逐渐阐明为组织工程的发展提供了强大的动力。在逐步认识细胞间相互作用促进组织器官形态发生的基础上，以去细胞化肝脏支架为平台，模拟器官发生形成过程，利用干细胞、非实质性细胞、细胞因子等，以细胞因子包埋或非实质性细胞填充构建合适的局部微环境，对干细胞进行程序化灌注，多向诱导分化共培养，最终获得功能性，血管内皮化，可移植利用的组织工程肝脏将成为一种新的、值得尝试的肝脏组织器官重建策略。

在血管化、可移植组织工程肝脏的构建上，Basak团队取得了巨大的突破，Nunes等对简单获取血管化肝脏类似物的研究同样令人鼓舞，但是现在所能得到的实验性组织工程肝脏及其类似物远未能进行临床试用。去细胞化支架的内皮化、多细胞共培养、干细胞的定向多向诱导分化以及之后对组织工程肝脏的神经支配系统的研究仍然需经历长期的探索。

综上所述，通过细胞间接共培养，在VEGF的介导下，HSCs可以促进rADSCs向ECs分化，增强分化后ECs的内皮细胞功能。通过对多种细胞，特别是非实质性细胞和干细胞，共培养体系深入的研究，可以为功能性血管化组织器官及其生物模拟物的设计和创造提供更加可靠的理论指导和更加广阔的研究策略。

[1] Badylak SF, Taylor D, Uygun K. Whole-organ tissue engineering:decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds [J]. Annu Rev Biomed Eng, 2011, 15(13): 27-53.

[2] Seong JM, Kim BC, Park JH, et al. Stem cells in bone tissue engineering [J]. Biomed Mater, 2010, 5(6): 062001.

[3] Sterodimas A, de Faria J, Nicaretta B, et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applications [J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2010, 63(11):1886-1892.

[4] Sadat S, Gehmert S, Song YH, et al. The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-I and VEGF [J].Biochem Biophys Res Commun, 2007, 363(3): 674-679.

[5] Colazzo F, Alrashed F, Saratchandra P, et al. Shear stress and VEGF enhance endothelial differentiation of human adiposederived stem cells [J]. Growth factors, 2014, 32(5): 139-149.

[6] White MP, Rufaihah AJ, Liu L, et al. Limited gene expression variation in human embryonic stem cell and induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells [J]. Stem cells, 2013, 31(1): 92-103.

[7] Uygun BE, Soto-Gutierrez A, Yagi H, et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix [J]. Nat Med, 2010, 16(7): 814-820.

[8] Aust L, Devlin B, Foster SJ, et al. Yield of human adiposederived adult stem cells from liposuction aspirates [J]. Cytotherapy, 2004, 6(1): 7-14.

[9] Zhao Y, Waldman SD, Flynn LE. Multilineage co-culture of adipose-derived stem cells for tissue engineering [J]. J Tissue Eng Regen Med, 2012,8.

[10]Nae S, Bordeianu I, Stãncioiu AT, et al. Human adipose-derived stem cells: definition, isolation, tissue-engineering applications[J]. Rom J Morphol Embryol, 2013, 54(4): 919-924.

[11]Nunes SS, Maijub JG, Krishnan L, et al. Generation of a functional liver tissue mimic using adipose stromal vascular fraction cell-derived vasculatures [J]. Sci Rep, 2013, 3, 2141.

[12]Traktuev DO, Merfeld-Clauss S, Li J, et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks [J]. Circ Res, 2008, 102(1): 77-85.

[13]Abu-Absi SF, Hansen LK, Hu WS. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells [J]. Cytotechnology, 2004,45(3): 125-140.

[14]Kasuya J, Sudo R, Masuda G, et al. Reconstruction of hepatic stellate cell-incorporated liver capillary structures in small hepatocyte tri-culture using microporous membranes [J]. J Tissue Eng Regen Med, 2012, 22.

[15]Kasuya J, Sudo R, Mitaka T, et al. Hepatic stellate cell-mediated three-dimensional hepatocyte and endothelial cell triculture model [J]. Tissue Eng Part A, 2011, 17(3-4): 361-370.

[16] Durdu S, Iskar M, Revenu C, et al. Luminal signalling links cell communication to tissue architecture during organogenesis [J].Nature, 2014, 515(7525): 120-124.