过表达HDR和ADS基因对青蒿素生物合成的影响

王亚雄，龙世平，曾利霞，向礼恩，林智，陈敏，廖志华

（1.西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715；2.四川省眉山第一中学，四川 眉山 620010；3.西南大学药学院，重庆 400715）

过表达HDR和ADS基因对青蒿素生物合成的影响

王亚雄1，龙世平1，曾利霞2，向礼恩1，林智1，陈敏3，廖志华1

（1.西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715；2.四川省眉山第一中学，四川 眉山 620010；3.西南大学药学院，重庆 400715）

青蒿素（Artemisinin）是从草本药用植物黄花蒿，俗名青蒿（Artemisia annua L.）中分离提取的一种含有过氧桥基团结构的新型倍半萜内酯，它是治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物[1]。WHO称青蒿素为“目前世界上唯一有效的疟疾治疗药物”[2]。目前，尽管很多国家已经可以防止和治疗疟疾，但全球每年还是会有约一百万人死于疟疾，使得青蒿素的需求量很大；同时，青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的发现[3,4]，使得青蒿素的市场前景更加广阔。Keasling[5,6]实验小组在酵母中重建代谢青蒿素生物合成途径，成功在其代谢产物中分离提纯到了青蒿素合成的前体物质，如青蒿酸、二氢青蒿酸等。通过这一技术生产的青蒿素将会成为市场供不应求状况下的一个良好补充，然而农业种植依然是青蒿素最根本的供应源。发展中国家通常采用农业种植青蒿并从中提取青蒿素以治疗疟疾，为发展中国家农民提供高产青蒿素的青蒿能够降低青蒿素的生产成本，稳定市场供应量，为农民带来直接经济利益，增加农民种植青蒿的信心[7]。目前，青蒿仍然是青蒿素唯一资源植物，但青蒿素含量较低，而且青蒿素价格相对较高，这使得青蒿素生产不能满足市场需求[8]。因而培育青蒿素高产青蒿成为该行业共同追求的目标，而植物代谢工程是遗传改良青蒿素生物合成途径、培育青蒿素高产青蒿的有效方法之一。

青蒿素生物合成途径已经基本阐明，途径中涉及到的结构基因大多已经克隆鉴定，为采用代谢工程方法培育青蒿素高产青蒿提供了基因资源。青蒿素可由位于植物质体的MEP途径提供基本5碳前体异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其同分异构体二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP），该途径中最后一步酶促反应是由羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶（hydroxymethylbutenyl4-diphosphate reductase，HDR）催化羟甲基丁烯基-4-磷酸还原生成IPP和DMAPP。HDR是MEP途径中的关键酶，也是遗传改造MEP途径重点考虑的靶点，本实验室报道了青蒿HDR基因可用于遗传改造青蒿MEP途径[9]。紫穗槐二烯合成酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）催化15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）环化生成紫穗槐二烯；紫穗槐二烯为青蒿素生物合成提供独有的倍半萜骨架[10]。ADS催化的环化反应是青蒿素生物合成途径限速反应，ADS是青蒿素生物合成途径中重要的关键酶[11]。

本文采用双基因共转化策略，在青蒿中同时过表达青蒿素生物合成途径关键酶基因HDR和ADS，以期打破青蒿素生物合成途径中瓶颈反应步骤，探讨HDR和ADS基因过表达在青蒿素合成中的作用，并为青蒿素生产提供青蒿素高含量转基因青蒿。

材料与方法

1 植物材料

青蒿种子来自于重庆酉阳青蒿生产基地，播种于西南大学温室，自主采收成熟种子备用。无菌萌发青蒿种子，作为实验材料。

2 菌株和质粒

大肠杆菌DH5α和土壤根癌农杆菌LBA4404保存于-80℃；植物高效表达载体p1304+[12]由本实验室廖志华教授改造获得。

3 总RNA提取及cDNA合成

叶片总RNA提取使用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒，紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，A260/A280均大于1.8小于2.1，表明RNA无蛋白和DNA污染，将质量合格的RNA用TaKaRaRNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行第一链cDNA的合成用于基因克隆。

4 载体构建及工程菌的获得

根据已报道的HDR基因（GenBank:GQ119345）和ADS基因（GenBank：HQ315833）设计特异引物（表1），fhdr带有酶切位点SpeⅠ，rhdr带有酶切位点NheⅠ；fads带有酶切位点BamHⅠ，rads带有酶切位点SacⅠ。用这两对引物从青蒿中克隆得到HDR和ADS基因的编码区序列，并将其构建到植物高效表达载体p1304+上，获得命名为p1304+-ADS-HDR的质粒（图1）。用p1304+-ADS-HDR转化土壤根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，最终获得目标工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR。

5 青蒿的遗传转化及分子检测

取青蒿无菌苗幼嫩叶片作为外植体，用工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR转化青蒿叶盘，在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+10 mg·mL-1潮霉素+250 mg·L-1头孢菌素固体培养基上培养4周左右可获得潮霉素抗性再生芽。除菌完全的株系用SDS法抽提基因组DNA，PCR检测潮霉素抗性基因（Hygr）和目的基因HDR与ADS，为避免扩增出青蒿内源的HDR和ADS基因造成假阳性，检测这两个基因所用的正向引物在CaMV 35S启动子区设计（F35S），反向引物分别为Rhdr和Rads；检测潮霉素抗性基因引物为FHygr和RHygr，相关引物序列见表2。加样体系：2.5 μL 10×PCR Buffer、1.5 μL 25 mmol·L-1MgCl2、2.0 μL 25mmol·L-1dNTP、0.5 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.5μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.75 μL DNA模板、0.25μL Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）和17.0 μL ddH2O，总体积25 μL。反应条件：95℃预变性8 min，30个循环（94℃变性30 s，退火58℃（Hygr），55℃（HDR），58℃（ADS），退火时间为30 s，72℃延伸1 min），最后72℃后延伸5 min。

6 青蒿素提取及HPLC-ELSD法检测

取青蒿组织于烘箱中45℃恒温干燥至恒重。将烘干的青蒿组织研磨成粉，按向礼恩[13]、张东[14]和Lu[15]等的方法提取青蒿素，并检测青蒿素含量，青蒿素标准品购自Sigma公司，每个转基因青蒿单克隆设3个生物学重复。色谱条件：色谱柱为Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm）；流动相为乙腈（acetonitrile）和水（体积比为60∶40）；流速为1 mL·min-1；蒸发光散射检测仪（增益为8）；载气为纯度0.999氮气；柱温箱温度为40℃。进样量为20 μL，每个样品重复进样3次。

7 引物设计与qRT-PCR

根据青蒿HDR和ADS序列，使用Beacon designer 2.06软件设计qPCR引物，见表3。使用IQ5 Multicolor Real-Time PCR仪，参照SYBRR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行qPCR反应。反应体系：10 μL 2×SYBRPremix ExTaqTM、0.8 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.8 μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.7 μL cDNA模板和7.7 μL RNase-Free H2O，总体积20 μL。反应程序：95℃ 30 s，接着进行35个扩增循环（95℃ 5 s，退火30 s，72℃ 20 s，延伸结束后采集荧光），退火温度ADS为61℃，HDR为61℃，β-actin为61℃；融解曲线分析：60℃到95℃逐渐升温，每间隔0.5℃保温10 s，采集一次荧光。以β-actin基因作为内参，根据2-△△Ct方法计算各基因的相对表达量。

结果与分析

1 转基因青蒿的获得与分子鉴定

p1304+质粒上T-DNA区携带有潮霉素抗性基因，所以经工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR转化后的转基因青蒿具有潮霉素抗性，能够在含有潮霉素的培养基上正常生长。叶盘法转化青蒿幼嫩叶片，暗培养2天后，在含有10 mg·L-1潮霉素的再生培养基上进行筛选诱导。4周左右叶片伤口处再生出芽，待其生长到2～3 cm高时剪下，在含有头孢菌素的MS培养基中进行除菌培养，除菌完全后的植株用于炼苗移栽。转HDR和ADS基因的转基因青蒿在形态上与非转基因青蒿没有明显区别（图2）。基因组PCR结果显示，在潮霉素抗性筛选获得的青蒿植株中有6个株系同时检测到812 bp的潮霉素抗性基因（Hygr）片段、411 bp的ADS（携带有部分CaMV 35S启动子序列）基因片段和236 bp的HDR（携带有部分CaMV35S启动子序列）基因片段（图3）。基因组PCR检测最终确认了6个双基因共转化青蒿株系，其编号依次为ah3、ah11、ah20、ah27、ah28、ah70。

2 青蒿素含量的测定

青蒿素标准品的保留时间为11.7 min（图4A）。样品的保留时间为11.6 min（图4B）。样品和标准品的保留时间基本一致，表明本研究中在青蒿提取物样品中检测到的物质为青蒿素。以非转基因青蒿作为对照，对6个转基因青蒿株系进行青蒿素含量分析。结果显示，在6个共转化ADS和HDR 转基因青蒿株系中，青蒿素含量都得到不同程度的提高。在6个转基因株系中，ah70株系青蒿素含量最高，达到0.53 mg·g-1DW，为非转基因对照植株中青蒿素含量（0.15 mg·g-1DW）的3.48倍（图5）；其次为ah11株系的青蒿素含量（0.51 mg·g-1DW）提高较多，为非转基因对照的3.32倍（图5）。这两个株系中青蒿素含量提高倍数比其他转基因株系中青蒿素含量提高倍数更为明显。转基因株系中ah3株系的青蒿素含量（0.27 mg·g-1DW）在所有转基因株系中含量提高最少，为非转基因对照的1.78倍（图5）。另外3个转基因青蒿株系ah20、ah27和ah28中青蒿素含量分别为0.46 mg·g-1DW、0.39 mg·g-1DW和0.47 mg·g-1DW，相对于非转基因对照都有显著提高（图5）。

3 目的基因HDR和ADS相对表达量检测

采用实时荧光定量PCR检测目的基因HDR和ADS的相对表达量。实验结果显示，ADS、HDR和β-actin基因的扩增效率分别为92.0%、94.7%、93.5%，都在90%～105%的有效统计范围内[16]；所得标准曲线相关性系数R2都在0.99以上，且融解曲线都只有单一的峰，无引物二聚体和非特异扩增，表明内参基因β-actin和目的基因ADS和HDR引物均符合实时荧光定量PCR的检测要求。

在6个共转化HDR和ADS转基因青蒿株系中，HDR基因表达量都比非转基因对照中HDR基因表达量高很多；但不同转基因株系中，HDR基因表达量高低有差异。与对照比较，转基因株系ah20中HDR基因表达量最高，为非转基因对照的2.90倍；转基因株系ah28中HDR基因表达量提高最少，为非转基因对照的1.73倍（图6）。HDR基因过表达，有利于打破青蒿素前体依赖于MEP途径生物合成中的限速反应，为青蒿素生物合成提供充足的前体物质IPP及其同分异构体DMAPP，从而促进青蒿素生物合成[8]。本实验室先前曾报道过表达MEP途径中第一个限速酶基因DXR，能够提高青蒿素含量，首次在转基因水平证明了MEP途径参与青蒿素生物合成[13]。本研究再次证明了基于MEP途径中有HDR催化的限速步骤的遗传改造也能够调控青蒿素生物合成。在所有转基因株系中，ADS基因表达量都有显著提高（转基因株系ah3除外），不同转基因株系中，ADS基因提高幅度差异较大（图7）。与对照比较，转基因株系ah27中ADS表达量提高最多，为非转基因对照的6.07倍；而转基因株系ah3中ADS基因表达与对照比较，没有显著性差异（图7），这有可能是转基因沉默引起的[17]。事实上ah3提供了一个很好的证据表明，即使是只有HDR基因表达量提高，也能够导致青蒿素合成的增加。ADS基因表达量提高，有利于将MEP途径提供的前体更多的环化成为青蒿素的倍半萜骨架紫穗槐二烯，从而使得由ADS催化的限速反应被打破，导致更多代谢产物向青蒿素合成方向流动，从而增强青蒿素生物合成[18]。

讨论

青蒿素具有独特的药用功效，但在青蒿中含量却很低，不同品种的青蒿中青蒿素含量差异很大，为满足市场对青蒿素的需求，已研究出多种提高青蒿素含量的方法。一是通过传统的栽培方法提高青蒿素的含量；二是通过植物激素提高青蒿素的含量；三是通过转基因技术提高青蒿素的含量。1996年，Vergauwe等[19]首次建立根癌农杆菌介导的青蒿遗传转化体系，通过转基因技术提高青蒿素含量显示出非常广阔的前景[20]。青蒿素的代谢途径现已研究的比较清楚，途径上关键酶基因都已经得到鉴定，使得利用转基因技术培育青蒿素高含量转基因青蒿成为可能。

青蒿素的生物合成途径属于典型的植物类异戊二烯代谢途径。其上游合成途径有两条，包括来自细胞质中的MVA途径和来自质体中的MEP途径。二者共同提供类异戊二烯化合物合成的基本单元IPP和DMAPP。其下游合成途径主要是FPP的环化和紫穗槐二烯的一系列官能化直至形成终产物青蒿素。青蒿素生物合成上游途径和下游途径都涉及到一系列的酶促反应步骤，有的反应步骤对整条代谢途径起到决定性作用，是整条途径代谢流向目标方向的瓶颈，催化限速反应的酶就是限速酶。代谢途径中限速步骤的突破往往能够增强代谢流往目标产物方向流动，因而限速步骤也就成为了代谢工程中最重要的遗传改良靶点[21]。打破特定代谢途径上目标代谢产物生物合成的限速步骤，经典的方法是针对特定代谢途径上的限速步骤，在存在该代谢途径的植物中过量表达单个或多个限速酶基因，使这些限速酶始终维持较高的表达水平，从而达到打破瓶颈、推动代谢流往目标产物方向流动的目的。过表达限速酶在青蒿素合成途径代谢工程中也得到了很好应用[22]。在青蒿中过表达长春花（Catharanthus roseus L.）的HMGR基因能够使青蒿素的含量提高22.5%[23]；在青蒿中同时过表达CYP71AV1和CPR基因使青蒿素含量提高38%[13]。在青蒿中同时转入FPS、CYP71AV1和CPR这3个基因能够使青蒿素含量提高3.6倍[24]。本研究中6个转基因青蒿株系中青蒿素含量与非转基因株系青蒿素含量相比都有不同程度的提高。说明HDR和ADS双基因共转化方法在一定程度上打破青蒿素生物合成途径中这两个限速反应步骤，推动代谢流更多的向青蒿素合成方向流动，提高了青蒿素的合成能力，最终表现为青蒿素含量提高。

摘编自《药学学报》2014年第9期：1346～1352页，图、表、参考文献已省略。