姜黄素对成骨细胞凋亡的影响

王雪梅，尚德浩

（1.中国医科大学口腔医学院牙体牙髓科，中国医科大学口腔医学院中心实验室，辽宁省口腔医学研究所牙体牙髓病学研究室；2.中国医科大学口腔医学院种植中心，沈阳 110002）

姜黄素对成骨细胞凋亡的影响

王雪梅1，尚德浩2

（1.中国医科大学口腔医学院牙体牙髓科，中国医科大学口腔医学院中心实验室，辽宁省口腔医学研究所牙体牙髓病学研究室；2.中国医科大学口腔医学院种植中心，沈阳 110002）

目的研究姜黄素对肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理成骨细胞引起凋亡的影响。方法将原代培养的大鼠成骨细胞分为3组：对照组（不做处理）、TNF-α处理组（10 ng/mL TNF-α处理24 h）、姜黄素预处理组（10 μmol/L姜黄素预处理2 h，10 ng/mL TNF-α处理24 h），通过Western blot方法检测Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-3、caspase-8及Bcl-2的蛋白水平，荧光显微镜下观察并计数成骨细胞的凋亡情况。结果与对照组相比，12和24 h时TNF-α处理组caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平均升高（P＜0.01），Bcl-2的蛋白水平无明显变化（P＞0.05）；12和24 h时姜黄素预处理组caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平均较TNF-α处理组明显降低（P＜0.01）。20倍荧光显微镜下观察可见，对照组凋亡的成骨细胞数目非常少，TNF-α处理组凋亡的成骨细胞数目明显增多，姜黄素预处理组凋亡的成骨细胞数目明显减少。结论姜黄素可以抑制TNF-α引起的成骨细胞凋亡。

肿瘤坏死因子α；成骨细胞；凋亡

与其他组织细胞相同，骨组织中的细胞凋亡是骨代谢的一种形式，成骨细胞参与了骨改建的过程。由于成骨细胞凋亡可减少成骨细胞数目，进而可以引发骨重建［1，2］。姜黄素是从一些植物根茎中提取的化学成分，可作为食品着色剂，具有抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗氧化等作用。近年来研究发现姜黄素对不同种类细胞所起的凋亡作用不同，对许多肿瘤细胞具有促进凋亡的作用［3～6］，而对白细胞介素1引起的关节软骨细胞凋亡具有抑制作用［7］。研究发现，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）通过肿瘤坏死因子受体1、肿瘤坏死因子受体2和死亡受体如Fas的相互作用，激活半胱氨酸蛋白酶（caspase）诱导成骨细胞凋亡［8，9］。本研究通过在成骨细胞中加入TNF-α，模拟根尖周炎或牙周炎时骨质所处的微环境，建立骨细胞的凋亡模型，通过Western blot方法检测加入姜黄素后凋亡相关蛋白水平的变化，探讨姜黄素对成骨细胞凋亡的影响，为牙周炎及根尖周炎的临床药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生24 h内的SD胎鼠，雌雄不限，体质量约6 g，由中国医科大学实验动物部提供。

1.2 主要材料与试剂

兔抗鼠Bcl-2抗体，兔抗鼠活性caspase-2、caspase-3、caspase-8抗体，兔抗鼠Fas抗体，兔抗鼠TRAIL抗体，购自美国Santa Cruz公司；姜黄素，购自美国Sigma公司；TNF-α，购自华美公司。

1.3 原代培养成骨细胞

进行成骨细胞培养，以1∶2进行传代，每隔2 d换液1次，5～7 d进行传代［10］。

1.4 Western blot实验

取第3～4代的成骨细胞以5×106/mL密度接种于6孔板，分为3组：对照组（不做处理）；TNF-α处理组（10 ng/mL TNF-α处理24 h）；姜黄素预处理组（10 μmol/L姜黄素预处理2 h，10 ng/mL TNF-α处理24 h）。分别在TNF-α处理成骨细胞12 h和24 h时收集细胞，细胞中加入蛋白裂解缓冲液，20 min后转移至EP管。每孔进行加样，转膜后在室温下将兔抗鼠Bcl-2抗体、兔抗鼠caspase-2、caspase-3、caspase-8抗体、兔抗鼠Fas抗体、兔抗鼠TRAIL抗体、稀释于封闭液中，与膜孵育4℃过夜。在室温下将辣根过氧化物酶标记的二抗稀释于封闭液中，与膜孵育60 min，加入显色液避光至条带出现。

1.5 应用TUNEL法原位观察成骨细胞凋亡

将无菌的盖玻片置于6孔板中，每孔1片。取对数生长期细胞以0.05%胰酶消化后，稀释成5×107/L，取0.5 mL滴于盖玻片上，37℃孵育2 h后，每孔加2 mL培养基，4%多聚甲醛固定细胞60 min，加配制好的生物素标记液，37℃孵育60 min，在样品上加50 μL过氧化物酶－链亲和素复合物工作液，室温孵育30 min，加入FITC标记的二抗，封片后荧光显微镜下观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-3、caspase-8及Bcl-2的蛋白水平

Western blot检测发现，对照组成骨细胞基础表达Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-3、caspase-8以及Bcl-2，TNF-α处理组在12和24 h时caspase-2、caspase-3、caspase-8c、Fas、TRAIL的蛋白水平均较对照组明显升高（P＜0.01），Bcl-2的蛋白水平无明显变化（P＞0.05）。姜黄素预处理组在12和24 h时caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平都较TNF-α处理组明显降低（P＜0.01或0.05），Bcl-2的蛋白水平无明显变化（P＞0.05）。见图1，表1。

图1 Western blot检测caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL和Bcl-2蛋白的表达Fig.1 Western blot analysis for caspase-2，caspase-3，caspase-8，Fas，TRAIL，and Bcl-2

表1 Western blot检测caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL和Bcl-2的表达水平Tab.1 Expressions of caspase-2，caspase-3，caspase-8，Fas，TRAIL，and Bcl-2 detected by Western blot

2.2 TUNEL法观察凋亡的成骨细胞

凋亡的成骨细胞标志为核染色质浓缩或形成各种形状的碎块。20倍荧光显微镜下观察可见：在无任何刺激存在的对照组凋亡的成骨细胞数目非常少（图2A），TNF-α处理组凋亡的成骨细胞数目明显增多（图2B），姜黄素预处理组凋亡的成骨细胞数目较TNF-α处理组明显减少（图2C）。

图2 TUNEL法观察凋亡的成骨细胞 ×20Fig.2 Apoptosis of osteoblasts detected by TUNEL×20

3 讨论

成骨细胞是参与根尖周骨质改建的主要细胞之一，成骨细胞最终有3种转归：一部分被埋于其自身分泌的骨基质中转换为骨细胞；一部分转变为静止的骨衬细胞；其余的则以凋亡的形式死亡［11，12］，成骨细胞的凋亡在骨重建中发挥重要作用［13，14］。研究证明，TNF-α可以引起成骨细胞凋亡［15～17］。本研究通过在成骨细胞中加入TNF-α，模拟根尖周炎或牙周炎时骨质所处的微环境，建立骨细胞凋亡模型。TNF-α引起成骨细胞凋亡的机制包括：（1）TNF-α受体死亡结构域需要通过Fas相关受体死亡结构域来激活caspase的级联反应；（2）TNF-α增强Fas配体或放线菌酮引起的凋亡刺激。Fas通过竞争抗体或者其成熟配体可以导致受体低聚反应，以及衔接蛋白和caspase-8前体的募集反应，进而形成诱导死亡的信号复合物，然后caspase-8前体被蛋白水解激活并分解为多种底物，包括caspase-3前体，从而完成凋亡过程。

由于TNF-α引起的成骨细胞凋亡与Fas、caspase-2、caspase-3、caspase-8等有关，所以本研究通过Western blot方法检测加入10 ng/mL TNF-α培养24 h时caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL的蛋白水平变化，结果发现蛋白水平均升高，Bcl-2作为抑制凋亡的蛋白表达无明显变化。姜黄素预处理组caspase-2、caspase-3、caspase-8和Fas、TRAIL的蛋白水平均较TNF-α处理组明显降低，此结果提示caspase-2、caspase-3、caspase-8、Fas、TRAIL凋亡相关蛋白参与了TNF-α诱导的成骨细胞凋亡，而姜黄素可以抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。Bcl-2与TNF-α诱导的成骨细胞凋亡无关，caspases-2和caspase-8由于含有较长的氨基端前结构域，作为启动子发挥作用，而caspases-3由于含有较短的氨基端前结构域，作为执行子发挥作用，普遍认为caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。因此TNF-α通过激活Fas、TRAIL、caspase-2、caspase-8进而启动caspase-3降解caspase的底物分子，发生不可逆转的凋亡。姜黄素通过抑制这些凋亡活化蛋白进而抑制了成骨细胞的凋亡。TUNNL结果显示，TNF-α处理成骨细胞24 h时凋亡的成骨细胞数目明显增多，而姜黄素预处理组凋亡的成骨细胞数目与TNF-α处理组相比明显减少（P＜0.01），与Western blot结果一致。

正常的根尖周组织和牙周组织处于一种平衡状态，这种平衡状态受机体内环境包括细胞因子网络系统制约。当细菌感染时，牙周袋或根管内细菌的毒素及其代谢产物诱导细胞产生大量的细胞因子，打破平衡，出现骨丧失。到目前为止，没有抑制牙周炎和根尖周炎引起骨丧失的理想药物。本研究发现姜黄素可以通过抑制TNF-α引起的成骨细胞凋亡，进而增加成骨细胞的数目，减少骨破坏的发生，为根尖周炎及牙周炎引起骨破坏的治疗提供实验依据。

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（编辑 陈 姜）

Effect of Curcumin on Tumor Necrosis Factor α-induced Osteoblast Apoptosis

WANG Xue-mei1，SHANG De-hao2

（1.Departments of Endodentics，Experimental Center，School of Stomatology，China Medical University，Institution of Oral Medicine，Shenyang 110002，China；2.Departments of Implant，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo study the effect of curcumin on tumor necrosis factor α（TNF-α）-induced osteoblast apoptosis.MethodsPrimary osteoblast cells were divided into three groups：control group（no treated），group treated with TNF-α（treated with TNF-α for24 h），and group pretreated with curcumin（treated with curcumin for 2 h，and then treated with TNF-α for 24 h）.Western blot analysis was carried out with primary antibodies against caspase-2，caspase-3，caspase-8，Bcl-2，Fas，and TRAIL.Apoptosis cells were observed by immunofluorescence microscope.ResultsIn group treated with TNF-α，the protein levels of caspase-2，caspase-3，caspase-8，Fas，and TRAIL increased（P＜0.01），whereas the protein level of Bcl-2 remained unchanged（P＞0.05）.In group pretreated with curcumin，the protein levels of caspase-2，caspase-3，caspase-8，Fas，and TRAIL were lower than those in group treated with TNF-α（P＜0.01）.The number of apoptotic cells was dramatically increased after the administration of TNF-α.While the number of apoptotic cells decreased in the presence of curcumin.ConclusionThe present study clearly demonstrated that curcumin can suppress osteoblast apoptosis induced by TNF-α.

tumor necrosis factor α；osteoblast；apoptosis

R781.4

A

0258-4646（2015）12-1094-04

辽宁省科技计划项目（2013225090）

王雪梅（1976-），女，副主任医师，博士. E-mail：wangxuemeisdh@hotmail.com

2015-09-13

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