沙棘叶总黄酮的提取纯化方法概况*

曾圣雅，周吉银

第三军医大学第二附属医院国家药物临床试验机构，重庆 400037

沙棘叶总黄酮的提取纯化方法概况*

曾圣雅，周吉银△

第三军医大学第二附属医院国家药物临床试验机构，重庆 400037

查阅国内外有关文献探讨从沙棘叶中提取纯化总黄酮的方法，指出提取方法有回流提取法、微波萃取法、普通超声提取法、循环超声提取法、微波超声双辅助提取法，其中回流提取率较高，微波法次之，但超声法和超声循环提取法可节约时间和能耗，效率也较高；纯化萃取方法有酸提碱沉法、膜过滤法、大孔吸附树脂法、聚酰胺洗脱法，其中优选膜过滤法和大孔树脂吸附法纯化后总黄酮含量较高且方法简便可行，成本较低。虽然对沙棘总黄酮的提取纯化方法的研究取得了一定进展，但还需摸索更有效的方法，并且需进一步提高提取率和萃取后总黄酮的含量。

沙棘叶；总黄酮；提取纯化

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名醋柳、酸刺，为胡颓子科植物沙棘属的一种野生浆果植物。在我国，沙棘主要分布于山西、西藏、青海、内蒙、陕西等省区，占世界沙棘资源的90%以上［1］。沙棘叶的化学成分主要有黄酮类、萜类及甾体类、挥发油类、有机酸、酚类、糖类等［2］。黄酮类包括山奈酚，3-O-β-D-葡萄糖-(6-O-对羟基反式香豆酰基)山奈素苷，熊果酸，异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1-2)-α-L-鼠李糖苷等［3-4］。总黄酮为沙棘中重要的活性成分，在沙棘的药用开发中占有重要地位。近年相关药理研究证实，沙棘总黄酮具有抗心肌缺血、抗心率失常、提高耐缺氧能力、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗炎、抗氧化、抗辐射和增强免疫力等功效［5］。本文对沙棘叶总黄酮的提取纯化方法研究作一综述，为相关研究提供参考。

1 沙棘叶总黄酮提取方法

1.1 水回流提取法 脱脂后叶渣挥发尽石油醚后加1 500m L水浸泡30分钟，回流30分钟，过滤；滤渣再分别用900m L，600m L水各回流30分钟，滤液合并后，冷却至室温，得水提取液［6]。另有加入碱性助提剂的方法为用50%的氢氧化钠水溶液调节p H值为8.5，加入10倍水回流两次，时间分别为1小时、0.5小时。所得沙棘总黄酮得率为1.04%，而不加入氢氧化钠助提剂10倍水回流提取总黄酮得率为0.88%［7］。邸多隆等［8］将沙棘叶50 g加入8倍量水，回流提取2次，每次2小时。总黄酮得率为24.88%，黄酮含量为3.12%，是水提取含量最高的方法。取10 g沙棘叶粉末加入100m L水回流提取2小时，过滤滤液后再加入80m L水回流1.5小时，总黄酮的得率为0.9278%［9］。另有研究根据正交试验最佳方法，取2 g沙棘叶粗粉加入12倍水溶剂提取2次，2 h/次，提取温度80℃，总黄酮提取率为0.83%［10］。加入β-环糊精2.0～5 g沙棘粗粉中，再加蒸馏水100m L，浸泡30分钟，加热回流1小时，过滤提取液后，将叶渣重复以上步骤一次，再合并滤液，测定得出沙棘黄酮含量为10.27%，此方法提取的黄酮含量较高［11］。

1.2 乙醇回流提取法

1.2.1 以50%乙醇为提取溶剂 黄酮苷类和极性较大的苷元，一般可用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮等提取［12］。用水提取，杂质较多，为进一步分离带来困难，且提取物不易保存。甲醇及其溶液提取效果虽然较好，但有毒性，因此较常选用乙醇、乙酸乙酯、丙酮为提取剂。乙醇较乙酸乙酯和丙酮提取率高，且乙醇毒性小，本身有杀菌作用，不易发霉变质，所以一般选择乙醇为沙棘叶黄酮的提取剂［13］。取10 g沙棘叶粉末粉碎，过60目筛，加10倍(v/m)石油醚(沸程60～90℃)45℃浸泡，以150 r/min震荡提取1.5小时，抽滤，共重复脱脂3次，弃去提取液，自然挥干后得脱脂叶渣［14］。加入50%乙醇10倍量回流提取2小时，再加入8倍量乙醇提取1.5小时，提取温度70℃，所得沙棘叶总黄酮的提取率为1.2582%［9］。

1.2.2 以60%乙醇为提取溶剂 称取脱脂的中国沙棘叶粉末2 g，加入60%乙醇30m L，加热回流2小时。过滤滤液后再分别加60%乙醇25m L回流2次，每次1小时，所得总黄酮含量为22.290m g/g［15］。而沙棘粗粉5 g加入60%乙醇100m L，回流提取1小时，过滤，再重复提取1次，滤液中沙棘总黄酮含量为11.98%［11］。

1.2.3 以70%乙醇为提取溶剂 称取沙棘叶20 g，加入提取溶剂回流提取黄酮，将提取液浓缩至干，即得总黄酮粗品。利用正交试验L9(34)优选沙棘叶醇提取总黄酮工艺条件时，对浸膏得率、总黄酮含量两个评价指标分别赋予不同的权重，考虑到总黄酮含量的重要性和生产成本，将浸膏得率的权重定为0.4，总黄酮含量的权重定为0.6，用综合评分优选最佳工艺为：乙醇浓度70%、温度80℃、料液比1∶l4、提取时间2小时，这种工艺可使黄酮提取率达97%以上［16］。另有研究表明10倍70%乙醇回流提取，时间分别为1小时、0.5小时，得率为1.088%［7］。

1.2.4 以80%乙醇为提取溶剂 称取5 g沙棘粉末，用石油醚回流去脂，烘干后量取80m L的80%乙醇，用50%的氢氧化钠水溶液调节p H值至9，回流6小时，提取过程避光。提出沙棘总黄酮的含量为27.354m g/g［17］。

1.3 超声波提取法

1.3.1 普通超声提取 其原理是利用超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等加速植物有效成分进入溶剂，提高提取效率，缩短提取时间，简化操作步骤。沙棘叶烘干，粉碎，过60目筛。精确称取沙棘叶粉若干份，每份2.0 g，分别加一定量的提取溶剂在超声波仪器中提取，提取液过滤，定容待测。确立的沙棘总黄酮的优化超声波提取工艺条件为：提取溶剂85%乙醇，料液比1∶25(g∶m L)，超声波温度46℃，作用时间25分钟，提取1次，提取率为1.72%［18］。又有研究人员通过二次通用旋转组合试验设计得出沙棘黄酮的超声波最佳提取条件是35倍量76.04%的乙醇，提取30.7分钟，超声功率561.5W，黄酮得率为10.51m g/g［19］。

1.3.2 循环超声提取 超声循环技术是在料液循环流动的过程中施加超声波，是一种提取天然产物的新技术。将处理过的样品用超声波循环装置进行提取，参数设定为：功率1千瓦，转速1 200 r/min，超声波工作315 s，间隔13 s。提取液经过滤后浓缩至干，即得总黄酮粗品。最后选择超声循环提取的溶剂体积分数为75%，提取时间为20分钟，提取率2.144%［8］，比单纯超声提取得率高，但装置更复杂。

1.3.3 微波超声双辅助提取 根据单因素试验结果采用响应面分析法得出最佳提取工艺条件为：乙醇浓度68.1%，固液比1∶17.7(g∶m L)，微波火力80%，辐射时间200 s，重复3次，沙棘叶总黄酮含量为42.75m g/g［20］。

1.4 微波萃取法 准确称取沙棘叶样品1 g置于烧瓶中，按不同溶剂和料液比处理后放入微波系统中，设置加热时间和微波功率后开启微波。微波结束后取出烧瓶待进一步冷却后测定总黄酮提取率［21］。在微波功率为400瓦时，最佳提取工艺条件料液比1∶25(g∶m L)，乙醇浓度为80%，微波时间90分钟，在此条件下沙棘总黄酮提取率可达5.23%［22］。微波水提取黄酮的最佳工艺条件为：微波功率360瓦，提取时间30分钟，沙棘叶粉与水的质量比为1∶30，提取率为1.21%［23］。在微波功率180瓦时，1.00g沙棘叶粉加入10倍量水，调节p H值为9.1，提取6分钟，黄酮的产率为3.697m g/g［24］。新疆沙棘叶粉末2 g用微波萃取3分钟，固液比1∶20，乙醇浓度60%，微波火力为60%，溶液p H值为10，沙棘叶总黄酮提取率最高为2.02%［25］。有研究表明通过正交试验筛选出的微波提取沙棘总黄酮的工艺条件为乙醇浓度75%，微波功率300瓦，提取时间2分钟，料液为1∶20，沙棘总黄酮提取率最高达3.9%［26］。

2 沙棘总黄酮的纯化方法

2.1 酸提碱沉法 沙棘黄酮提取液中的主要杂质为：沙棘油、蛋白质、单糖和多糖、胶质、色素等［27］。将沙棘黄酮提取液用大孔树脂吸附和解吸附后的提取物粗粉，加入盐酸乙醇溶液水解，再用氢氧化钠溶液将p H值调至7～9，加入弱极性或中极性有机溶剂进行重复萃取，弃去水相，合并浓缩萃取液，浸膏得率大于1%，总黄酮含量为20%～90%［28］。有试验研究用1∶1盐酸调节水提取液的p H值至3时使黄酮苷沉淀析出。再用30%乙醇淋洗得产品，所得产品黄酮含量达8.4%，黄酮得率为1.05%［10］。

2.2 膜过滤法 将沙棘黄酮粗提液用1 500～2 000道尔顿的膜进行过滤，其滤液再经200道尔顿膜过滤，再经减压干燥得沙棘黄酮粉末，结果以沙棘叶为原料的沙棘黄酮提取率为1.35%，总黄酮含量55.5%［29］，方法简便可行无污染，适合工业化生产。

2.3 大孔吸附树脂法 大孔树脂是一类有机物高分子吸附剂，具有物化稳定性高、吸附选择性好、再生简便、使用周期长等优点，广泛应用于总黄酮的分离纯化。Y W D12G大孔吸附树脂显示出较好的吸附和解吸附性能［30］。将已预处理的中极性或强极性大孔吸附树装入树脂柱后，加入黄酮提取液，上样流速为0.2～2.0 B V/h(B V表示柱内树脂床体积)，待大孔树脂完全吸附沙棘黄酮后，先用水洗至流出液无色或淡棕色，再用50%～95%乙醇溶液梯度洗脱，洗脱流速为0.5～1.0 B V/h，树脂层径高比为1∶1.5～20［31］。收集洗脱液，浓缩得沙棘总黄酮苷含量为20%～40%［32］。另用乙醇已处理的50g D101大孔树脂以湿法装柱，大量蒸馏水冲洗至无醇味后，准确量取总黄酮含量为5.917m g/m L的浸膏15m L，反复上柱，然后用60%乙醇洗脱，纯化后的总黄酮产率为1.611%，纯度为20.18%［33］。有研究表明F L-1树脂对沙棘黄酮具有良好的吸附洗脱性能，沙棘叶质量与树脂的体积比为1∶2，70%乙醇作为洗脱剂，4倍床体积的条件下洗脱较为理想［34］。E G D M A比例为 15%的酰胺基树脂E15NC吸附选择性最佳。

以沙棘叶粗提物为原料，可得到质量分数达42.7%的沙棘叶总黄酮提取物。结论：兼具疏水性和氢键作用力相互协同作用的酰胺基树脂可高选择性地吸附沙棘叶粗提物中的黄酮类成分，达到富集提纯沙棘叶总黄酮的目的。

2.4 聚酰胺洗脱法 将沙棘叶粗提物与1～5倍量聚酰胺粉末混合拌匀，上样于20～60倍量层析用聚酰胺装成的层析柱上，先用至少2倍柱体积的水洗去杂质，再依次用10%～100%梯度浓度的极性有机溶剂洗脱沙棘黄酮，极性溶剂优选甲醇。流速1～3 B V/h，收集洗脱液，浓缩得到沙棘黄酮，含量可达50%～100%［35］。

3 小结

每一种提取方法中，对于同一体积分数的乙醇，随着提取时间的增加，提取率升高，达到一定程度后提取率随着时间的增加而降低。提取方法中索氏回流提取率较高，但超声法和超声循环提取法与索氏提取相比所用时间短、效率高、方法简便，提取工作在室温下进行，可避免高温对提取成分的影响，对优化操作条件具有重要意义。纯化方法中聚酰胺洗脱法纯化率较高，但洗脱溶剂甲醇污染大。酸提碱沉法步骤繁琐，且有机溶剂污染大成本较高，不适合工业生产。因此沙棘叶总黄酮纯化方法可以优选膜过滤法和大孔树脂吸附法。黄酮类化合物的分离纯化方法较多，但均因存在不同程度的缺点而限制了其工业化生产［36］。总体分析，沙棘的基础性研究开展得不够，沙棘中许多活性物质的化学、药学和药理研究亟待深入。目前，国内外开发出的以沙棘或沙棘中有效成分为主要原料的单方、复方药物制剂、保健品等产品十分丰富，未来沙棘有效成分的提取分离，技术将向着更高效、精细、环保、产业化的方向发展，使这一天然绿色资源得以更广泛的开发和利用［37］。

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A Survey on the Extracting and Purifying Methods of Total Flavonoids in Seabuckthorn Leaves

ZENG Shengya,ZHOU Jiyin△
National Drug Clinical Trial Institution of The Second Affiliated Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037,China

The pertinentdocumentsathome and abroad were consulted to survey the extracting and purifying methods for total flavonoids from seabuckthorn leaves.The main extraction methods concluded were refluxing method,conventional ultrasonic method,circulating ultrasonicmethod,m icrowavemethod aswell asm icrowave and ultrasonic auxiliarymethod,amongwhich the refluxingmethod wasw ith better extracting rate and the nextwas microwavemethod,but the ultrasonicmethod and circulating ultrasonicmethod can reduce time and energy w ith good efficacy.Themethods for the purification included alkaliextraction and acid precipitationmethod,membrane filtrationmethod,macroporous resin adsorptionmethod and polyamide elutionmethod.Among them,the filtration method w ith preferred adsorptionmembrane andmacroporous resinmethod are simple and feasiblew ith lower cost to purify the total flavonoids.A lthough the extraction and purificationmethods had been improved in a certain degree,themore effectivewaysneed to be developed to furtherenhance the extracting effectand increase the contents of total flavonoidsafter purification.

seabuckthorn leaves;total flavonoids;extraction and purification

R284.2

A

1004-6852(2015)03-0136-04

2014-02-27

国家自然科学基金青年基金(编号81100597)；第三军医大学校级科研课题创新基金(编号2012XJQ17)。

曾圣雅(1986—)，女，药师。研究方向：药理学。

△通讯作者：周吉银(1979—)，男，博士学位，主管药师。研究方向：药理学。