不同开口饵料对草鱼幼鱼生长及糖代谢的影响

李 姣 梁旭方 方 刘 易提林 许 艳 孙龙芳 章文婧霍 达 钱艳红

(华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070)

不同开口饵料对草鱼幼鱼生长及糖代谢的影响

李 姣 梁旭方 方 刘 易提林 许 艳 孙龙芳 章文婧霍 达 钱艳红

(华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070)

碳水化合物是水产饲料三大能源中最廉价的饲料能源, 适当提高饲料中碳水化合物水平可以提高蛋白质的利用率, 节约饲料蛋白质和脂肪[1]。近20年来, 关于鱼类糖营养的研究比较活跃, 在糖的生理功能、鱼类对饲料糖的利用特点、影响因素和需求量等方面都取得了一定的突破[2]。与陆生动物相比, 鱼类对饲料中糖的利用能力较低。鱼类是先天性的糖尿病患者, 饲料中糖水平超过一定限度就会引发鱼类抗病力低、生长缓慢、死亡率高等症状[3]。因此, 鱼类糖代谢及利用机理的研究已成为目前的研究热点。

殷名称[4]认为早期生活史阶段存在着两个过渡期,即卵黄囊期仔鱼(Yolk-sac larva)和变形期仔鱼(Transformation larva), 这两个期间的仔鱼, 其形态、生态和生理变化相当剧烈。目前, 国内外关于鱼类早期营养干预的研究已经广泛开展。Geurden等[5]分别在肉食性鱼类虹鳟(Oncorhynchus mykiss)早期开口和卵黄囊完全吸收两个阶段进行短期的高糖饲料饲喂, 然后在幼鱼期投喂略高于该鱼适宜碳水化合物水平的饲料, 发现开口期处理的虹鳟 α-淀粉酶和麦芽糖酶的基因表达都提高了, 而卵黄囊完全吸收时处理的虹鳟只有α-淀粉酶基因表达升高。Fang 等[6]通过在斑马鱼(Danio rerio)早期开口阶段混合营养期和外营养期进行短期高碳水化合物饲料投喂, 发现早期营养干预对成年斑马鱼的生长没有显著性影响, 但在糖代谢基因的分子、生理生化水平上产生了永久性可塑性的代谢影响。Vagner等[7]通过在两个饲养温度下, 幼年欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)仔鱼孵化后 6—45d投喂低或高含量高度不饱和脂肪酸(HUFA)饲料, 再经过中间 3个月的常规商品饲料养殖后, 发现早期生活史对幼年欧洲鲈的生长性能没有显著性影响, 投喂缺乏HUFA饲料对Δ6去饱和酶基因的转录具有显著性的正调节作用, 并且鱼体对极性脂类和脂肪酸的利用能力提高。

草鱼(Ctenopharynodon idellus)作为我国的特有种,是我国主要的淡水养殖鱼类之一。目前, 草鱼的养殖产量排在全球淡水养殖产量的第二位, 仅次于银鲤(Hypophthalmichthys molitrix)[8]。研究草鱼幼鱼对碳水化合物的利用能力有助于正确评价饲料营养价值。本试验将在草鱼仔鱼期饲喂不同开口饲料, 分别为浮游动物、高糖饲料和商品饲料。通过测定生长、血糖、糖原和糖代谢相关基因表达等指标, 来探讨草鱼仔鱼期不同开口饵料对草鱼幼鱼生长及糖代谢的影响, 为草鱼早期营养提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼种、饵料和饲养管理

试验鱼苗为湖北省仙桃市排湖渔场同一批孵化的草鱼苗, 开口后用于试验。分别以含量为60%麦芽糊精的配合饲料(自己配置)、商品饲料(购于武汉高龙饲料有限公司)、浮游动物(华中农业大学南湖基地捞取, 显微镜下观察, 确定其构成以轮虫为主, 并混有少量枝角类)作为试验饵料, 三种饵料的主要营养成分分析见表1。

每种开口饵料饲喂组设3个平行, 每个平行随机选择200尾个体大小均匀的健康草鱼, 于室内循环流水过滤水族箱(10.3 L)中进行10d的养殖试验, 结束后于每个平行组挑选个体大小均匀的健康鱼苗各35尾[平均体重为11 mg, 体长为(7.81±0.08) mm], 放入养殖循环系统(350 L)进行为期56d饲养试验的管理, 投喂草鱼幼鱼商品饲料(同开口期商品饲料)。

日投喂率为鱼体重的2%—4%, 分2次投喂, 8:00—9:00和16:00—17:00各投一次。每次投喂适量, 0.5h后观察吃食情况, 估计采食量使鱼体饱食而无饲料剩余, 并把多余饲料吸出, 浮游动物用60目滤网捞出。水源为曝气除氯的自来水, 5d换水一次, 每次换水1/3。日夜连续充气增氧, 饲养过程中每天8:00及16:00各测水温一次, 维持水温在25—27℃之间。

1.2 样品的采集与分析

饲养56d后, 饥饿24h, 随机从每平行组取10尾鱼, 用MS-222(200 mg/L)麻醉鱼体, 测量体重和体长; 随机从每试验组取10尾鱼, 其中4尾使用血糖仪(Accu-Chek Performa, Roche)测量其血糖含量, 另外6尾鱼取肌肉, 肝脏各两份样品, 做好标记, 一份放入液氮中速冻, 并于–80℃保存, 用于分子生物学测定; 另一份冻存于–20℃用于糖原测定。

1.3 分子生物学测定

引物设计与合成 GK: 上游: 5′-GAAGAGCGAG GCTGGAAGG-3′; 下游: 5′-CAGAATGCCCTTATCCAAA TCC-3′。PEPCK: 上游: 5′-ATCGTCACGGAGAACCAA-3′;下游: 5′-CCTGAACACCAAACTTAGCA-3′。

RNA的抽提 取肝脏50—100 mg, 参照Trizol Reagent (Invitrogen公司)说明书操作, 抽提总RNA。使用紫外分光光度计测定RNA的浓度, 并根据A260/A280值判断RNA的质量, 判定范围为1.8—2.0。

RT-qPCR 反转录反应使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(Takara公司)获得单链cDNA。后采用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行Real Time PCR扩增反应。荧光定量PCR反应液组成: 5 μL SYBR premix Ex TaqTM(2×)、0.5 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)、0.5 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L)、0.5 μL模板(cDNA溶液)、3.5 μL ddH2O。反应条件: 95℃30s; 95℃ 10s, 57℃ 30s, 40个循环; 72℃ 3min; 融解的反应条件为65—95℃, 每升高0.5℃保持5s读板记录荧光量。

1.4 糖原测定

肝(肌)糖原采用试剂盒(南京建成科技有限公司)测法,使用紫外分光光度计, 在波长为620 nm处进行吸光度测定。1.5 数据统计与分析

数据采用SPSS 18.0统计软件进行单因子方差分析(One-way ANOVA), 多重比较用Ducan’s进行差异显著性检验, 当P＜0.05时, 差异显著, 结果用平均值±标准误差表示。基因表达水平以草鱼β-actin为内参基因, 应用2–∆∆Ct公式确定mRNA的相对表达量[9]。

2 结果

2.1 不同饲料早期投喂对草鱼生长性能的影响

采用3种饵料饲养开口草鱼仔鱼10d, 后进行56d商品饲料的饲养, 均投喂至饱食, 各试验组摄食活跃, 其中浮游动物组摄食较两个饲料组更加活跃, 两饲料组摄食活跃度无明显差异(P＞0.05)。各个试验组的体重和体长数据见表2。试验结果显示, 浮游动物组的体重和体长显著高于高糖饲料组和商品饲料组(P＜0.05), 高糖饲料组与商品饲料组间无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 不同饲料早期投喂对草鱼血糖水平和糖原含量的影

响

三种开口饵料饲喂组的血糖水平见表2。商品饲料组血糖水平最高, 高糖饲料组次之, 浮游动物组最低。浮游动物组与高糖饲料组血糖水平无显著性差异(P＞0.05), 商品饲料组与其他两组均有显著性差异(P＜0.05)。

表1 三种饲料主要营养成分Tab. 1 Ingredient formulation of the three diets

表2 八周饲养后的生长及血糖变化Tab. 2 Growth performance and plasma glucose after 8 weeks feeding experiment

三种开口饵料饲喂组的肝糖原含量见图1。本研究发现, 商品饲料组肝糖原含量最高, 且与其他两组之间有显著性差异(P＜0.05)。高糖饲料组次之, 浮游动物组最低。两组之间无显著性差异(P＞0.05)。肌糖原含量见图 2。商品饲料组肌糖原含量最高, 浮游动物组次之, 高糖饲料组最低。并且, 三组之间有显著性差异(P＜0.05)。

2.3 不同饲料早期投喂对GK、PEPCK基因表达的影响

三种开口饵料饲喂组的GK基因相对表达量见图3。以浮游动物组为对照, GK基因的表达量为1.114 ± 0.58,显著性低于其他两组(P＜0.05), 商品饲料组表达最高, 高糖饲料组次之, 且两组之间表达量无显著性差异(P＞0.05)。

三种开口饵料饲喂组的PEPCK基因表达量见图4。以浮游动物组为对照, PEPCK基因的表达量最高, 为1.144 ± 0.64, 商品饲料组次之, 高糖饲料组最低, 三组之间无显著性差异(P＞0.05)。

图1 不同处理组之间的肝糖原含量Fig. 1 Effects of different diets on hepatic glycogen contents

图2 不同处理组之间肌糖原含量Fig. 2 Effects of different diets on muscle glycogen contents

图3 不同处理组之间GK mRNA表达Fig. 3 Effects of different diets on GK gene expression

3 讨论

鱼类在仔鱼期形态、生态和生理变化相当剧烈[4], 研究该时期营养刺激对机体或各器官功能可能产生的长期影响具有重要的理论与实践意义。

图4 不同处理组之间PEPCK mRNA表达Fig. 4 Effects of different diets on PEPCK gene expression

Geurden 等[5]对肉食性鱼类虹鳟仔鱼期的短期高糖刺激发现, 幼年虹鳟的葡萄糖激酶(GK)等糖代谢相关基因表达出现上调, 认为高糖刺激可对虹鳟的糖酵解途径产生长期的影响。本试验室对斑马鱼进行了早期高糖饲喂,提高了GK的表达量, 降低了PEPCK表达量, 可认为早期高糖刺激可以增强糖酵解能力, 抑制糖异生能力[6]。本试验以草鱼为研究对象, 在仔鱼期以高糖短期刺激, 以确定是否能够提高草鱼幼鱼在碳水化合物利用率方面的长期持久性的代谢变化的可能性。

3.1 不同饲料早期投喂对草鱼生长性能的影响

鱼类在仔鱼期食性由混合营养期逐渐过渡到外营养期, 消化代谢能力发生剧烈的变化, 以确保能够高效利用外来营养[10]。当卵黄囊不再能满足幼鱼代谢需要, 它们必须开始摄取外来营养。研究证明, 多数鱼类在仔鱼阶段的食性为肉食性, 然后才逐渐分化为各种不同的食性[4]。在自然条件下, 草鱼以浮游动物为开口饵料, 故选用浮游动物组作为对照。在饲喂微颗粒饲料后, 商品饲料组和高糖饲料组的草鱼的体重和体长显著低于浮游动物组(P＜0.05), 出现该结果一方面可能由于浮游动物组摄食较两个饲料组活跃, 另一方面可能是微颗粒饲料在草鱼仔鱼期不能满足草鱼仔鱼期的营养需求。

3.2 不同饲料早期投喂对草鱼血糖水平和糖原含量的影响

血糖水平是反映动物糖代谢和全身组织细胞功能状态以及内分泌机能的一个重要指标, 同时也可以反映饵料和营养是否适当、肝脏机能是否良好[2]。有研究表明,在发育的关键或敏感时期的营养刺激会对虹鳟机体或各器官功能产生长期的影响, 可能对鱼体利用碳水化合物具有促进作用[5]。本实验室在对斑马鱼的研究中发现, 与对照组相比, 仔鱼期的短期高糖饲喂可有效降低成年斑马鱼糖耐量后的血糖水平[6], 本试验也得到了与上述研究结果类似的结果, 高糖饲料组血糖水平显著低于商品饲料组(P＜0.05), 这可能是由于葡萄糖被鱼体组织吸收,或是葡萄糖磷酸化水平得到了提高。高糖饲料组与浮游动物组血糖水平无显著性差异(P＞0.05), 说明高糖饲料作为开口饵料可与草鱼在自然条件下摄食浮游动物一样, 能有效地调节血糖水平。

血糖水平是由生成速率和消除速率共同决定的, 而有关糖类代谢去路包括糖原的合成、脂肪合成、代谢甚至排泄[11]。付世建[11]对南方鲇(Silurus meridionalis Chen)饲喂高糖饲料时, 认为糖原的合成和分解在同时进行, 一方面为了快速清除高血糖水平, 糖原合成途径活跃; 另一方面由于肝脏糖原库容量有限, 在长期高糖饲料喂养下, 肝脏糖原在摄食前已很高, 因此糖原在不断动员和分解以腾空糖原库。肝脏糖原含量的变化, 取决于两个方向反应的活跃程度及相对大小的变化。普遍认为肝糖原的合成与分解主要是为了维持血糖浓度的相对恒定[12], 但是, 由于大多数鱼类不能很好地利用鱼体糖原作为代谢能源物质, 这种积累的糖原只是鱼体在高血糖条件下的被动适应, 即储存起来以免对机体造成危害, 积累的糖原只能通过某种途径加以清除, 因此肝糖原可能成为鱼体的代谢负担[11]。高糖饲料组肝糖原含量与浮游动物组没有显著性差异(P＞0.05), 商品饲料组显著高于其他两组(P＜0.05), 以浮游动物组为健康的蓄积量, 可认为高糖饲料组储存肝糖原含量较商品饲料组产生的代谢负担小。在肌肉中糖原的合成与分解主要是为肌肉提供 ATP[12], 有学者认为肌肉糖原含量与摄入的饲料糖没有显著相关性,高糖饲料不会引起肌肉糖原的明显增加[13]。高糖饲料组肌糖原含量显著低于浮游动物组(P＜0.05), 笔者认为早期高糖刺激并不能提高草鱼幼鱼肌糖原的储存能力。而商品饲料组肌糖原显著高于其他两组(P＜0.05), 这可能与商品饲料中较高的脂肪含量有关。

3.3 不同饲料早期投喂对GK、PEPCK基因表达的影响

有研究表明, 鱼类饲料中碳水化合物含量对一些糖代谢酶的基因表达具有调控作用[14]。糖代谢酶在肝脏中的合成速度与其mRNA水平密切相关, 而mRNA又受到基因转录及mRNA本身稳定性的控制[15]。

葡萄糖激酶(GK)是糖酵解过程在肝脏中调节血糖的重要的限速酶。试验中浮游动物组GK mRNA表达量最低,且与其他两组之间有显著性差异(P＜0.05)。此试验结果与之前在虹鳟上发现的结果一致[5]。这些发现可说明葡萄糖激酶可受到早期营养刺激的影响发生变化。机体在饥饿状态下, GK mRNA表达量上升, 糖酵解能力增强, 进而分解葡萄糖供能。商品饲料组GK mRNA表达量高于高糖组,但并无显著性差异(P＞0.05), 这与Capilla等[16]认为虹鳟GK的表达量和活性随饲料碳水化合物含量按比例增加的结论相悖。初步推测, 饲料中碳水化合物含量达到阈值,则对草鱼肝脏GK基因表达不产生显著性影响。

磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)是肝和肾中糖原异生的关键酶, 主要在肝脏、肾脏和脂肪组织中表达[15]。它可催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸, 其转录水平的高低, 决定了糖异生的速度[17, 18]。试验发现, 浮游动物组、商品饲料组和高糖饲料组三组PEPCK mRNA表达量无显著性差异(P＞0.05), 这与 Panserat等[19]对虹鳟、Tranulis等[20]对大西洋鲑(Salmo salar)、Borrebaek等[21]对河鲈(Perca fluviatilis)的研究结果相同, 可认为早期高碳水化合物刺激不能影响草鱼 PEPCK的 mRNA表达水平, PEPCK的表达水平不受饲料碳水化合物的反馈抑制[22, 23]。因此, 一些研究者提出, 鱼类对血糖水平的调控能力低可能与摄食碳水化合物后鱼体缺乏糖异生酶的调控有关[24]。

本试验在草鱼仔鱼期短期高糖刺激后, 降低了血糖水平, 促进了肝脏GK基因的表达, 说明短期高碳水化合物刺激可增强草鱼的糖代谢过程, 提高草鱼幼鱼对糖的利用能力, 但影响糖代谢的机理仍需进一步研究。

[1] Li A J. Nutrition and Feed of Aquatic Animals [M]. China Agriculture Press. 1996, 26—36 [李爱杰. 水产动物营养与饲料学. 中国农业出版社. 1996, 26—36]

[2] Cai C F, Chen L Q. The metabolism of dietary carbohydrate by fish [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(4): 592—597 [蔡春芳, 陈立侨. 鱼类对糖的代谢. 水生生物学报, 2008, 32(4): 592—597]

[3] Wilson R P, Poe W E. Apparent inability of channel catfish to utilize dietary mono and disaccharides as energy source [J]. Journal of Nutrition, 1987, 117(2): 280—285

[4] Yin M C. Advances and studys on early life history of fish [J]. Journal of Fisheries of China, 1981, 15(4): 348—358[殷名称. 鱼类早期生活史研究与其进展. 水产学报, 1981, 15(4): 348—358]

[5] Geurden I, Aramendi M, Zambonino-Infante J, et al. Early feeding of carnivorous rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with a hyperglucidic diet during a short period: effect on dietary glucose utilization in juveniles [J]. American Journal of Physiology-regulatory Integrative and Comparative Physiology, 2007, 292(6): 2275—2283

[6] Fang L, Liang X F, Zhou Y, et al.Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio [J]. British Journal of Nutrition, 2014, 111(5): 808—818

[7] Vagner M, Infante J L Z, Robin J H, et al. Is it possible to influence European sea bass (Dicentrarchus labrax) juvenile metabolism by a nutritional conditioning during larval stage [J]? Aquaculture, 2007, 267(1): 165—174

[8] FAO. The State of World Fisheries and Aquaculture 2012 [M]. Rome. 2012, 209

[9] Livak K J, Thomas T D. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2–∆∆Ctmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402—408

[10] Hoehne-Reitan K, Kjorsvik E. Functional development of the liver and exocrine pancreas in teleost fish [C]. American Fisheries Society Symposium. American Fisheries Society. 2004, 9—36

[11] Fu S J. Glucose metabolism of carnivorous fish -- for example in Silurus meridionalis [J]. Reservoir Fisheries, 2007, 27(5): 109—111 [付世建. 肉食性鱼类的糖代谢--以南方鲇为例. 水利渔业, 2007, 27(5): 109—111]

[12] Yang L. Effect of three glycometabolic modulators on growth, serum biochemical indices and glycometabolism in Carassius auratus gibelio [D]. Wuhan Polytechnic University, Wuhan. 2009 [杨玲. 三种糖代谢调控剂对异育银鲫生长, 血液生化指标及糖代谢的影响. 武汉工业学院, 武汉. 2009]

[13] Banos N, Baro J, Castejon C, et al. Influence of high carbohydrate enriched diets on plasma insulin levels and insulin and IGF2I receptors in trout [J]. Regulatory Peptides, 1998, 77(1—3): 55—62

[14] Cai C F. Study on the utilization of dietary carbohydrate by Mylopharyngodon Piecus Richardson and Carassius Auratus and their mechanism of metabolism [D]. East China Normal University, Shanghai. 2004 [蔡春芳. 青鱼和鲫对饲料糖的利用及其代谢机制的研究. 上海, 华东师范大学. 2004]

[15] Luo Y P, Xie X J. Progress of carbohydrate utilization in fish [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2010, 17(2): 381—390 [罗毅平, 谢小军. 鱼类利用碳水化合物的研究进展. 水产动物科学, 2010, 17(2): 381—390]

[16] Capilla E, Medale F, Navarro I, et al. Muscle in sulin binding and plasma levels in relation to liver glucokinase activity, glucose metabolism and dietary carbohydrates in rainbow trout [J]. Regulatory Peptides, 2003, 110(2): 123—132

[17] Matte A, Tari L W, Goldie H, et al. Structure and mechanism of phosphoenolpyruvate carboxykinase [J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(13): 8105—8108

[18] Goto M, Yoshioka T, Battelino T, et al. TNFα decreases gluconeogenesis in hepatocytes isolated from 10-day-old rats [J]. Pediatric Research, 2001, 49(4): 552—557

[19] Panserat S, Plagnes-Juan E, Kaushik S. Hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression is not repressed by dietary carbohydrates in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J]. The Journal of Experimental Biology, 2001, 204: 359—365 [20] Tranulis M A, Dregni O, Christophersen B, et al. A glucokinase-like enzyme in the liver of Atlantic salmon (Salmo salary) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 1996, 114B: 35—39

[21] Borrebaek B, Christophersen B. Hepatic glucose phosphory lating activities in perch (Perca fluviatilis) after different dietary treatments [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 2000, 125(3): 387—393

[22] Zhao W P, Liu Y J, Pan Q, et al. Changes of blood sugar and liver glycogen levels after feeding in Grass Carp [J]. Acta Scientiarum Universities Sunyatseni, 2002, 41(3): 64—67[赵万鹏, 刘永坚, 潘庆, 等. 草鱼摄食后血糖和肝糖原质量分数的变化. 中山大学学报(自然科学版), 2002, 41(3): 64—67]

[23] Borrebaek B, Christophersen B. Activities of glucose phosphorylation, glucose -6-phosphatase and lipogenic enzymes in the liver of perch, Perca fluviatilis, after different dietary treatment [J]. Aquaculture Research, 2001, 32(1): 2 21—224

[24] Caseras A, Metn I, Vives C, et al. Nutritional regulation of glucose-6-phosphatase gene expression in liver of the gilthead sea bream (Sparusaurata) [J]. British Journal of Nutrition, 2002, 88(6): 607—614

EFFECTS OF INITIAL FEEDING ON THE GROWTH AND GLUCOSE METABOLISM OF JUVENILE GRASS CARP (CTENOPHARYNODON IDELLUS)

LI Jiao, LIANG Xu-Fang, FANG Liu, YI Ti-Lin, XU Yan, SUN Long-Fang, ZHANG Wen-Jing, HUO Da and QIAN Yan-Hong
(Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

开口饵料; 糖代谢; 草鱼

Initial feeding; Glucose metabolism; Grass carp (Ctenopharynodon idellus)

S965.1

A

1000-3207(2015)04-0811-05

10.7541/2015.106

2014-03-26;

2014-11-25

全国大学生创新创业训练计划创新训练项目(201210504173); 淡水健康养殖关键技术与集成示范(2012BAD25B04)资助

李姣(1991—), 女, 河北省张家口人; 硕士研究生; 主要从事健康养殖研究。E-mail: 345750141@qq.com

梁旭方(1965—), 男, 博士, 教授; E-mail: xufang_liang@hotmail.com