胰岛素样生长因子-1及转化生长因子-β2对幼年及成年兔软骨细胞合成糖胺多糖的影响

李　锋　聂喜增　刘金辉　关　健　王华军(石家庄市第三医院，河北　石家庄　050000)

胰岛素样生长因子-1及转化生长因子-β2对幼年及成年兔软骨细胞合成糖胺多糖的影响

李锋聂喜增刘金辉关健王华军
(石家庄市第三医院，河北石家庄050000)

〔摘要〕目的观察胰岛素样生长因子(IGF) -1及转化生长因子(TGF) -β2对体外培养的幼年及成年兔软骨细胞合成糖胺多糖的影响。方法取2月龄幼年及12月龄成年雄性新西兰大白兔，采用酶消化法取兔软骨细胞并培养于第2代软骨细胞，随机分为四组进行培养，分别为空白对照组; IGF-1组; TGF-β2组; IGF-1+TGF-β2组。每周传代1次，连续5 w，用Alcian blue法分别测定留取培养液中GAG的含量;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况，比较各组的变化。结果幼年组GAG的分泌能力优于成年组;第二代传代细胞分泌GAG的能力最强; IGF-1及TGF-β2均可促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质，IGF1+TGF-β2组明显优于其他组(P＜0.05)。结论外源性IGF-I和TGF-β2可促进不同年龄兔关节软骨细胞增殖和GAG的分泌，联合应用发挥协同作用，提示外源性生长因子可抑制软骨细胞在体外培养的老化过程。

〔关键词〕骨关节炎;软骨细胞;组织工程;转化生长因子-β2;胰岛素样生长因子-1;糖胺多糖

第一作者:李锋(1964-)，男，主任医师，主要从事关节外科的临床与基础研究。

外伤和疾病引起的软骨损伤和缺损是临床常见疾患，常常导致受累关节出现肿胀、积液、疼痛及交锁等功能障碍，但由于关节软骨自身修复能力极其有限，因此造成软骨的永久性损伤，严重影响患者的关节功能和生活质量〔1〕。以往的治疗方法如软骨钻孔术、自体或异体软骨组织移植术等有较大的困难及局限性。近年来随着生物医学工程的发展，组织工程概念被引入到软骨缺损的治疗中。在软骨组织发育生长过程中细胞因子起到了重要的调控作用〔1～3〕，其中胰岛素样生长因子(IGF) -1及转化生长因子(TGF) -β2能够促进软骨细胞增殖、维持软骨细胞稳定性和促进软骨细胞持续分泌软骨相关基质。糖胺多糖(GAG)是软骨的主要组成之一，软骨细胞合成GAG能力是反映其分化的重要指标〔2～4〕。本研究探讨IGF-1和TGF-β2对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和合成GAG能力的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物与主要试剂选取雄性新西兰大白兔10只，分为幼年兔组(2月龄，约1.8 kg)和成年兔组(12月龄，约3.5 kg)。IGF-1、TGF-β2、胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶(均购自Sigma公司)，胎牛血清购于中国医学科学院血液学研究所，CO2培养箱购于北京医疗设备厂。

1.2软骨细胞的分离培养与传代使用空气栓塞法处死动物，在无菌条件下将两组动物的膝关节游离并用骨剪截取，用生理盐水充分漂洗，充分刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，后使用D-Hank液充分漂洗。用刀片削取关节表面的软骨，充分漂洗软骨小块，用眼科剪剪碎至1 mm3，用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。加入适量Ⅱ型胶原酶，37℃消化4 h，每1 h吹打1次，成混悬液。分别接种到25 ml的培养瓶，5％ CO2，37℃培养，每2天换液1次，细胞融合80％后传代扩增以备用。分别选择幼年及成年兔第二代软骨细胞各自分为四组:只加DMEM作为空白对照;加含IGF-1 (50 ng/ml)的DMEM为IGF-1组; TGF-β2组加含TGF-β2 (10 ng/ml)的DMEM; IGF-1+TGFβ2组加含IGF-1(50 ng/ml)、TGF-β2(10 ng/ml)的DMEM。

1.3观测指标

1.3.1软骨细胞形态和生长情况取第2代软骨细胞，用0.1％胰酶消化，吹打成细胞悬液，1 200 r/min离心，弃上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2遍，连续传5代。隔日倒置显微镜观察两组细胞形态和增殖情况。

1.3.2GAG的检测采用Alcian blue染色沉淀法测定。培养液上清由－20℃冰箱中取出，置于4℃冰箱中解冻。取标准品和样本各100 μl加入不同的1.5 ml eppendorf离心管中，分别加入8 mol/L盐酸胍50 μl，摇匀后再分别加入50 μl试剂，摇匀静置10 min，各加入650 μl冰冻试剂过夜。将过夜的溶液在12 000 r/min的条件下离心15 min，各取700 μl上清液分别移入新1.5 ml离心管，各加入500 μl Alcian blue染液，摇匀后静置至少1 h，然后再在同样条件下离心15 min，弃去上清液，分别加入750 μl DMSO洗液，震荡0.5 h，同样条件下离心15 min，弃去上清液，再分别加入500 μl分散液，震荡15 min后，在600 nm波长下用酶标仪测定GAG含量。

1.4统计学方法应用SPSS15.0软件，计量资料组间比较采用t检验和方差分析进行组间比较。

2　结果

2.1细胞形态的观察刚分离收获的幼年兔及成年兔关节软骨细胞呈球形悬浮在培养液中，有较强折光性。培养24 h后细胞开始贴壁，细胞逐渐变为透明圆盘状。培养48 h后细胞基本贴壁固定，少量铺展，形态由圆盘状逐渐向外伸出突起而成多角形，少数呈梭形。随着细胞数量增加体积增大，细胞形态趋于一致。3～4 d后集落逐渐形成，其中集落周边细胞较中心瘦长，为长多边形。培养1 w后细胞逐渐融合，排列紧密，呈“铺路石”样外观。

2.2GAG含量的检测结果幼年及成年兔各组GAG含量比较，第3周IGF-1+TGF-β2组GAG含量最多，其次是TGF-β2组及IGF-1组，最少的是对照组，见表1，表2。

表1　幼年兔各组GAG含量(±s，ng/ml)

表1　幼年兔各组GAG含量(±s，ng/ml)

分组　1 w　2 w　3 w　4 w　5 w对照组　10.21±1.93　13.10±2.36　16.01±2.26　15.12±2.74　13.02±2.33 IGF-1组　12.26±2.03　16.82±2.43　20.25±2.75　18.53±2.26　15.18±2.56 TGF-β2组　13.24±2.12　17.37±2.66　21.85±2.77　19.54±2.35　16.51±2.74 IGF-1+TGF-β2组　15.64±3.64　20.81±3.86　29.78±3.34　22.71±3.16　19.36±2.75

表2　成年兔各组GAG含量(±s，ng/ml)

表2　成年兔各组GAG含量(±s，ng/ml)

分组　1 w　2 w　3 w　4 w　5 w对照组　9.13±1.76　11.26±1.91　15.32±2.37　14.85±2.26　11.25±2.57 IGF-1组　10.15±2.12　15.43±2.46　18.58±2.43　16.69±2.17　13.27±2.83 TGF-β2组　11.76±2.51　16.61±2.73　19.16±2.57　17.34±2.36　14.11±2.39 IGF-1+TGF-β2组　13.34±2.91　18.73±3.02　27.37±3.83　20.56±3.71　17.52±2.69

3　讨论

软骨是构成人体的重要组成部分，主要由软骨细胞、纤维结缔组织和细胞外基质组成。GAG与轴心蛋白、透明质酸支架形成的蛋白聚糖是软骨基质的主要成分。GAG可与水分子结合，具有膨胀压力，使软骨富有弹性，从而起到维持软骨承重能力的作用〔1，2〕。GAG由软骨细胞合成分泌，因此合成GAG的能力是反映软骨细胞分化的重要指标。由于软骨不含神经、血管和淋巴管，供应软骨的营养物质通过软骨外血液和淋巴液渗透进入软骨基质，营养软骨细胞。因此，极小的软骨损伤就不能完全恢复。目前临床上常用的自体及异体软骨移植、微骨折及病区剥削等方法整复软骨缺损，但是都具有一些缺点，如供体组织数量有限、异体移植的免疫排斥反应、新生组织无法恢复软骨的原有承重、耐磨以及高弹性模量、不能耐受足够的压力以及组织退变等〔2～4〕。

以往的研究已经证实细胞生长因子在软骨细胞的生长和分化起着促进作用，已成为软骨组织工程研究中的热点之一〔3～6〕，具有调理代谢、促进有丝分裂和成熟分化的生理功能，主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化;调节蛋白质、糖及脂肪的代谢。生长因子不仅参与软骨细胞的增殖、分化和基质代谢活动，同时作为信号物质参与软骨修复的调节。在关节软骨损伤的治疗过程中，尤其对于仅有局限软骨缺损的关节，可以刺激关节面的恢复，促进新关节面的形成。若将生长因子连同细胞移植，对治疗单纯软骨和年轻人的早期软骨退化效果更为显著〔5～8〕。在众多的生长因子中，TGF-13、骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-1及成纤维细胞生长因子能延缓体外培养细胞的老化和去分化，促进软骨细胞增殖、分化。IGF-1则是软骨代谢和维持软骨内环境稳定的最关键的生长因子之一，具有刺激软骨细胞集落形成和分裂增殖、促进软骨细胞集落和结节形成的作用;可保持软骨细胞活性，促进其逆分化，促进成熟软骨细胞DNA合成和细胞增殖加速，细胞外基质分泌，增加软骨组织胶原和前列腺素合成等作用;阻止软骨基质中金属蛋白酶的表达，从而起到抑制蛋白多糖退变的作用;刺激Ⅱ型胶原及聚胺多糖的合成，稳定体外培养软骨细胞的软骨表型〔9，10〕。

TGF-β2又称为软骨因子B，对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。在软骨组织的生长发育以及再生与修复等生理病理过程中起重要作用，是参与组织工程疗法治疗软骨疾患的重要细胞因子〔7～10〕。以往的研究证实TGF-β2能够诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，促进软骨细胞分泌软骨相关基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖。TGF-β2还具有双向调节作用，促进分化早期或者未分化的软骨细胞增殖分化和合成软骨相关基质，对于分化末期的软骨细胞，则往往抑制软骨细胞外基质钙化和碱性磷酸酶活性，减缓其分化速度。此外，TGF-β亚型mRNA及相关受体在骨关节炎患者的软骨组织中表达与损伤程度呈正比，并介导肌腱-骨愈合反应，TGF-β2还可以调节其他细胞因子如IGF、骨形成蛋白及纤维母细胞生长因子，并共同参与软骨细胞生长分化，因此可以联合应用TGF-β2及其他激活物共同诱导软骨分化。在本研究中证实IGF-1与TGF-β2单独及联合应用可以维持细胞表型，促进GAG分泌，二者联合使用对软骨细胞产生协同作用。其联合应用能显著促进软骨细胞增殖和细胞外基质产生，较单独使用效果更佳，证明二者在促进软骨组织形成中具有协同作用。软骨组织形成过程是由多种细胞因子共同操控和影响的，而单一细胞因子的作用往往具有局限性，随着对各种因子之间的相互作用的研究，已经发现有多种细胞因子在关节软骨细胞体外培养中表现出协同作用〔11，12〕。这些研究表明一种细胞因子不仅调控本身或其他细胞因子的受体表达，还可以调节另一种细胞因子的合成和分泌，从而通过不同的信号传导途径传入细胞内，经过几条信号传导途径的综合放大，从而产生更强的刺激作用〔7～11〕。

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〔2015-01-05修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:王华军(1982-)，男，博士，主要从事关节外科的临床与基础研究。

基金项目:石家庄市科学技术研究与发展指导计划(No．04146973)

〔中图分类号〕R68

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4458-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.017